菌源性β葡萄糖苷酶特性的研究

大豆異黃酮可調控動物機體養分代謝，改善飼料利用率，可改善動物產品的品質，并有抗氧化作用，提高動物免疫功能和生產機能。因此，大豆異黃酮在畜禽營養中的作用越來越受到關注。但是大豆異黃酮主要以結合型的糖苷（glucosides）形式存在，從大豆中提取的大豆異黃酮中游離型的苷元占總量的2％～3%，結合型的糖苷占總量的97％～98%。研究發現：結合型的糖苷不具有最佳的生理活性狀態，只有大豆異黃酮糖苷被水解脫去糖基轉化成游離型的苷元形式才能被動物體吸收，發揮生理調節作用。β-葡萄糖苷酶能使生物活性因子大豆異黃酮苷等生物苷類物質脫去糖基，變成分子量較小的高生物活性苷元，進而提高生物利用率。β-葡萄糖苷酶（bata-Glucosidase）系統名稱為β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶（bata-D-glucoside glucohydrolase;EC.3.2.1.21），它是纖維素酶系中的一個組分，主要作用于β-1，4糖苷鍵，還能作用于β-1，1、1，2、1，3、1，6糖苷鍵。目前市售商品β-葡萄糖苷酶主要是從酵母、苦杏仁等植物種子中分離純化而獲得的，主要應用于食品、飼料工業中，如青梅脫苦、降解纖維素等。微生物生長速度快，能分泌多種胞外酶，并且成本低廉，是β-葡萄糖苷酶的重要來源。揚樹林等（2006）用微生物發酵法和DEAE-SephadexG100離子交換法從綠色木酶發酵物中分離純化出一種分子量為64.7 kD的β-葡萄糖苷酶，并對酶學性質進行了初步的研究。本文利用從大豆發酵物中篩選出的一株β-葡萄糖苷酶高產菌株進行液體發酵，得到β-葡萄糖苷酶粗酶液，進行相關的酶學性質研究，以便于該酶的進一步開發利用，同時為大豆異黃酮微生物酶轉化工藝的研究提供參考依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 培養基
發酵培養基組成為蛋白胨0.2％、水楊苷0.05％、麩皮2％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.1％、VC 0.1％。
1.1.2 主要試劑
DEAE-SephadexA50(Sigma公司生產)、標準β-葡萄糖苷酶(Sigma公司生產，100 U)、標準分子量蛋白(上海生物化學研究所提供)、十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑為國產電泳純，其它試劑為國產分析純。
1.1.3 主要儀器
層析柱、TH-梯度混合器、BSZ-100自動收集器、HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠生產)、電泳儀(北京六一儀器廠生產)、723分光光度計(上海精密儀器廠生產)、臺式低溫高速離心機(Sigma公司生產)，其它儀器為實驗室常規設備。
1.2 方法
1.2.1 菌種的培養
將發酵培養基組分用蒸餾水溶解并定容至1 000 ml，分裝到500 ml三角瓶中，裝量為80 ml；121 ℃滅菌20 min，無菌操作接入42 h的種子培養液；在溫度為30 ℃，搖床轉數160 r/min條件下培養72 h，合并發酵液，離心(1 000 r/min)除菌，收集上清液即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。
1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性測定
1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作
采用分光光度法。取8只帶有刻度的比色管，精密吸取葡萄糖標準液（1 mg/ml）各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml于比色管中，再用蒸餾水補足至2 ml，分別加入1.5 ml DNS試液，置于沸水浴5 min，用蒸餾水定容至10 ml，于540 nm處比色，繪制標準曲線，見圖1。曲線方程為Y=2.281 19X-0.001 83，r=0.997 9。

1.2.2.2 樣品中β-葡萄糖苷酶酶活的測定
取4只10 ml的比色管，其中1只為對照管，3只為樣品管于每只比色管中分別加入0.5%的水楊苷0.5 ml后，在對照管中再加入DNS試液1 ml；然后將4只比色管在50 ℃水浴中放置5 min；再向每只比色管中分別加入酶液0.5 ml；將4只比色管放在50 ℃環境中水浴30 min后，向樣品管加入DNS試液1 ml；將4只比色管沸水浴5 min后，分別用蒸餾水定溶至10 ml，于540 nm波長測定吸光度值。酶活單位規定為每小時生成1 μmol/ml的葡萄糖為一個酶活單位(U)。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶分子量的測定
經過搖床發酵培養，得到發酵液，離心收集上清液，緩慢加入硫酸銨進行分步鹽析，相對飽和度為濃度為35％～75%；離心收集沉淀物，用pH值4.50檸檬酸緩沖液(0.1 mol/l)溶解，經透析后，依次用DEAE-SephadexA50離子交換柱吸附，再用0.1～0.8 mol/l氯化鈉溶液梯度洗脫步驟進行分離純化后，用SDS-PAGE電泳以確定分子量。
1.2.4 粗酶最適作用溫度
酶與底物反應30 min,在30、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下分別測定β-葡萄糖苷酶酶活。設最高酶活為100%。
1.2.5 粗酶最適作用pH值
用不同pH值的檸檬酸緩沖液（0.1 mol/l）調節反應體系中的pH值，在最適反應溫度條件下，分別在pH值3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7環境下測定β-葡萄糖苷酶酶活。設最高酶活為100%。
1.2.6 粗酶的熱穩定性實驗
將粗酶液分別放在30、40、50、60、70 ℃條件下保溫6 h，每1 h測定一次β-葡萄糖苷酶酶活。未經過保溫處理的為對照組，活性設為100%。
1.2.7 金屬離子對粗酶酶活的影響
在反應體系中添加一定濃度的金屬離子至終濃度為0.01 mol/l，考察其對β-葡萄糖苷酶酶活的影響。以未加入金屬離子的酶液為對照組，活性設為100%。
1.2.8 底物濃度對粗酶反應速度的影響及熱學動力學參數Km和Vmax的測定
用pH值4.5的檸檬酸緩沖液(0.1 mol/l)配置0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%的水楊苷為底物，測定與不同濃度底物反應時的β-葡萄糖苷酶酶活，考察不同底物濃度對酶反應速度的影響，同時采用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk)推導出Km和Vmax值。
2 結果與分析
2.1 β-葡萄糖苷酶分子量的測定
粗酶液經過35％～75%分步鹽析和用DEAE-SephadexA50離子交換柱吸附、梯度洗脫等步驟分離純化后，當氯化鈉洗脫液濃度為0.2～0.4 mol/l及0.6 mol/l時得到兩個有β-葡萄糖苷酶酶活的蛋白峰，收集酶活峰各管，透析后用聚乙二醇濃縮后，用SDS-PAGE分析，其中一個酶活峰是一條單一的蛋白帶，分子量為44 kD，見圖2。

2.2 粗酶最適作用溫度
在不同的反應溫度下測定粗酶β-葡萄糖苷酶酶活。圖3顯示，在30～55 ℃條件下，β-葡萄糖苷酶酶活隨溫度的升高而增加，在55 ℃時β-葡萄糖苷酶酶活達到峰值，說明55 ℃是該酶最適作用溫度。

2.3 粗酶最適作用pH值
按照文中方法，分別在pH值3～7環境下測定酶活。由圖4表明，緩沖體系中的pH值小于3.5時顯著影響β-葡萄糖苷酶酶活，在pH值3.5～5.5內酶活相對穩定，最適作用pH值為4.5。

按照文中方法，考察溫度對酶穩定性的影響。圖5表明，溫度對酶的穩定性有很大的影響，在30～70 ℃范圍內殘留的酶活隨著溫度的升高和保溫時間的延長酶活降低，且溫度越高降低速度越快，在50 ℃以下保溫1 h，酶活力降低緩慢，殘留的酶活在80％以上，在40 ℃下保存5 h，殘留的酶活在50%以上。
2.5 金屬離子對粗酶酶活的影響（見圖6）

在反應體系中添加一定濃度的金屬離子，測定酶活。圖6表明，金屬離子不同程度的抑制粗酶β-葡萄糖苷酶酶活性，其中以Hg、Al、Pb最為嚴重，可能是引起了蛋白質變性。
2.6 底物濃度對粗酶反應速度的影響及熱學動力學參數Km和Vmax的測定
按照文中的方法，分別測定酶與不同濃度底物反應時的反應初速度。圖7表明：當底物濃度增大，酶反應速度增加；底物濃度在0～0.2%范圍內為一級反應；底物濃度在0.2％～0.6%時隨著底物濃度的增加，酶反應速度不再和底物濃度成正比例的方式增加，為混合級反應；底物濃度在大于0.6%時，酶被底物飽和，為零級反應。按照雙倒數作圖法求得熱學動力學參數Km和Vmax值分別為0.729×10-2 g/ml、1.36×10-2 mg/(ml·min)。

3 討論
3.1 液體發酵液經過除菌、硫酸銨分段鹽析、DEAE-SephadexA50離子交換柱梯度洗脫收集活性峰時，當氯化鈉洗脫液濃度為0.2～0.4 mol/l時，收集到的蛋白活性峰為三條蛋白帶，分子量分別為97、44、36 kD，當氯化鈉洗脫液濃度為0.6 mol/l時，分離純化得到電泳純的β-葡萄糖苷酶，分子量約為44 kD。可見，氯化鈉洗脫液濃度為0.6 mol/l時分離效果最佳。
3.2 通過對菌源性β-葡萄糖苷酶特性研究結果表明：粗酶最適作用溫度為55 ℃，溫度對該酶穩定性影響顯著，但1 h內在50 ℃以下酶穩定性良好；最適作用pH值為4.5，在pH值3.5～5.5范圍內酶活比較穩定；金屬離子對酶活有不同程度的抑制作用；熱動力學參數Km和Vmax分別為0.792×10-2 g/ml、1.36×10-2 mg/(ml·min)。初步的試驗證明，該酶性質比較穩定，對底物親和力較強，具有較大的開發利用價值。