菌種保藏的方法（二）

 （五）甘油懸液保藏法
　　
　　此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用-20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可達10年。
　　
　　將擬保藏菌種對數期的培養液直接與經121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
　　
　　（六）冷凍真空干燥保藏法
　　
　　冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質。
　　
　　由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍干機等設備。
　　
　　保藏菌種需用時，可在無菌環境下開啟安瓿管，將無菌的培養基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復水，然后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養即可。
　　
　　（七）液氮超低溫保藏法
　　
　　液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內因自由水凝結成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min的速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細胞內自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細胞。據研究認為降溫的速度控制在（1～10）℃/min，細胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應提高。
　　
　　液氮低溫保藏的保護劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護劑，再通過試驗加以確定保護劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
　　
　　此法操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上，是目前被公認的最有效的菌種長期保藏技術之一。除了少數對低溫損傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優點是可使用各種培養形式的微生物進行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養物或固體培養物均可采用該保藏法。其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。
　　
　　要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養基斜面上進行培養。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質量。并且取樣時一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。
　　
　　（八）宿主保藏法
　　
　　此法適用于專性活細胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。它們只能寄生在活的動植物或其他微生物體內，故可針對宿主細胞的特性進行保存。如植物病毒可用植物幼葉的汁液與病毒混合，冷凍或干燥保存。噬菌體可以經過細菌培養擴大后，與培養基混合直接保存。動物病毒可直接用病毒感染適宜的臟器或體液，然后分裝于試管中密封，低溫保存。
　　
　　在上述的菌種保藏方法中，以斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法最為簡便，砂土管保藏法、麩皮保藏法和甘油懸液保藏法次之；以冷凍真空干燥保藏法和液氮超低溫保藏法最為復雜，但其保藏效果最好。應用時，可根據實際需要選用。
　　
　　在國際著名的“美國典型培養物收藏中心”（簡寫ATCC），僅采用兩種最有效的保藏法，即保藏期一般達5～15年的冷凍真空干燥保藏法與保藏期一般達15年以上的液氮超低溫保藏法，以達到最大限度地減少傳代次數，避免菌種變異和衰退的目的。我國菌種保藏多采用3種方法，即斜面低溫保藏法、液氮超低溫保藏法和冷凍真空干燥保藏法。