菌落總數檢測的注意事項與快速檢測技術

引言

   食品安全事件的頻頻發生，使得民眾對食品安全問題越來越關注。為了確保食品安全，政府部門除了要出臺相關法律法規外，更為重要的是要建立起更為科學的食品安全性的檢測技術。規范的檢測方法是有效保障食品安全的重要環節，它要求檢驗數據具有更高的準確度和可信度。食品中菌落總數反映了食品在生產過程中的衛生情況，體現食品被細菌污染的程度，是做出科學衛生評價的重要指標之一[1]。本文主要對國標法微生物檢測中菌落總數測定采用的傳統方法即平板計數法的注意事項進行相關的分析，并著重介紹了快速檢測技術在菌落總數檢測中的應用。
一、傳統檢測方法
  1 傳統檢測方法的流程圖[2] 2 注意事項
     國標法測菌群總數是以檢樣中的細菌細胞和營養瓊脂混合后，每個細菌細胞都能形成一個可見的單獨菌落的假定為基礎的。由于檢驗中采用37℃于有氧條件下培養(空氣中含氧約20％)，因而并不能測出每g或ml檢樣中實際的總活菌數，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長，有特殊營養要求的一些細菌也受到了限制，因此所得結果，只包括一群能在普通營養瓊脂中發育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細菌菌落的總數。國標法檢測應注意以下問題：
  2.1 所用器皿及稀釋液
  2.1.1 檢驗中所用玻璃器皿，如培養皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質。 2.1.2 用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。 2.1.3  檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細菌細胞有更好的保護作用，不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細菌細胞導致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進行稀釋，則需采用蒸餾水。
  2.2 樣品稀釋
  2.2.1  檢樣稀釋時,無菌稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或ml)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)，經充分振搖作成1:10的稀釋液。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時，每一步都應該搖勻試管或反復吹吸，使菌體能夠盡量分散均勻。如系肉、魚等固體樣品，最好剪細于滅菌乳缽內與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質器杯中，以8000-10000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1：10稀釋液。對于像食醋或酸性飲料等酸度較高的樣品，如果直接用原樣液來檢測菌落總數，結果會偏低甚至為0  ，只有嚴格按標準要求先用滅菌的20-30%碳酸鈉溶液將其PH值調至中性后方可準確檢測出菌落總數[3]。 2.2.2  根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，將上述1：10的檢樣稀釋液再做成幾個適當的10倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1ml與9ml稀釋液混和做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1  000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支1ml滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數方為準確。 2.2.3 從吸管筒內取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內的吸管的外露部分；而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側部分；因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。 2.2.4  在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內不能低于液面62.5px；吸入液體時，應先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內壁使吸。管內液體調至所要求的刻度，這樣取樣較準確，而且在吸管從稀釋液內取出時不會有多余的液體粘附于管外。     2.2.5 當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內時，應小心沿管壁加入，不要觸及管內稀釋液，以防吸管尖端外側部分粘附的檢液也混入其中。
  2.3 平板接種與培養
  2.3.1  將稀釋液加至滅菌平皿內時，應根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2—3個適宜稀釋度，分別在作1O倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lml稀釋液加入皿內(從皿側加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應作2個平皿。 2.3.2  培養溫度，應根據食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養，水產品用30℃培養。培養時間為48±2h。其他食品，如清涼飲料，調味品，糖果、糕點．果脯，酒類(主要為發酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2h培養。培養溫度和時間之所以有這種不同的區分，是因為在制定這些食品衛生標準中關于菌落總數的規定時，分別采用了不同的溫度和培養時間所取得的數據之故。水產品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產品細菌方面的衛生標準時，系用30℃作為培養的溫度。
  2.4 菌落計數
  2.4.1  在進行菌落計數時，有一些樣品的殘渣會在視覺上與菌落混淆，因此，在進行計數時應該仔細分辨。菌落的形狀相對規則，比較有光澤度，更飽滿，而樣品的殘渣比較不規則，沒有菌落的飽滿度和光澤度。另外，還可向培養基中添加一定濃度的TTC，可以使菌落成紅色，便于觀測和計數，但TTC的濃度不宜過高，否則會抑制菌落的生長[4]。 2.4.2  從溫箱內取出平皿進行菌落計數時，應先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數應該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數則應與檢樣稀釋倍數成反比，即檢樣稀釋倍數越大，菌落數越低，稀釋倍數越小，菌落數越高。 2.4.3菌落計數所得結果，可分別按以下幾種不同情況作報告。 2.4.3.1若1個稀釋度的平均菌落數在30—300之間，則將該菌落數乘其稀釋倍數報告之。 2.4.3.2若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30—300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應報告其平均數。 2.4.3.3 若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。 2.4.3.4 若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
  二、快速檢測新技術
  1 3M測試片快速分析技術
  1.1 3M測試片快速分析技術概念   3M測試片法是一種便捷可再生水化干膜，適用于細菌和真菌的計數。 1.2 檢測步驟 
  只需三步就可實現快速準確的測定。 1.3結果判讀
  ①測試片中含有一種紅色指示染劑可使菌落著色,計算所有紅色菌落(不論其大小和顏色深淺均計算之). ②測試片上沒有任何菌落生長. ③有不多的菌落. ④測試片菌落數適宜計數范圍是25-250 ⑤測試片面積約為500px2,當菌落數超過250個,如5所示,為了估計菌落數,可選擇其中一個或數個有代表性菌落的小方格(25px2),計算平均菌落數,再乘以20可得到整個測試片上的菌落數. ⑥ 測試片上菌落太多而無法計數 ⑦有很多高數量菌落,使整個生長區變粉色，應計錄為菌落太多無法計數。

⑧有時菌落分布出現不均衡,如8所示,這也記錄為菌落太多無法計數。

⑨測試片上的菌落,最先粗略一看是可計數的,然而,你密切注意到生長區邊緣,能看到高密度的菌落,應記錄為菌落太多無法計數。

1.4 測試片法特點
  1.4.1 工作效率的極大提高    根據大量數據統計，使用 3M測試片技術， 可以提高實驗室工作效率 118% 以上。勞動資源的最佳使用帶來生產能力的提高，最終的效果就是效益的增加。  1.4.2 標準化的檢測方法    品質穩定的快速測試片克服了傳統的測試方法存在的由于使用不同批次的培養基，不同的配制條件，不同配制人員而導致的差異性。  1.4.3 國際化的認證方法    3M快速測試的方法得到包括 AOAC，AFNOR 在內的國際權威機構的認證，在全球許多國家也已獲得官方機構的正式批準，從而可以確保檢測結果的可靠性和在世界各地的廣泛認可。  1.4.4 快速得到檢測結果  對比傳統的測試方法， 3M快速測試片縮短檢測時間，使您在更短的時間內獲得樣品的測試結果，能更加迅速地采取有效的措施解決發現的問題。  1.4.5 方便進行HACCP 認證    由于檢測速度快，檢測項目全，準確性高。3M為食品生產工藝過程中關鍵控制點的監控提供了較為完整的系列產品，可以對包括生產線，生產設備和環境在內的各個環節進行全面的測試。
  2 ATP法
  2.1 ATP熒光法檢測總菌落數原理
     螢火蟲會發光是由于它能合成將化學物質的化學能轉變為光能的生物催化劑—熒光素酶、蟲熒光素(D-luciferin)以及所有細胞生物都產生的生物能量物質—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發生氧化反應，形成氧化熒光素并發出熒光，其生化反應式如下：
  2.2 ATP法特點：
  2.2.1 具有成本低，操作簡單，響應速度快等特點 2.2.2 微生物 ＡＴＰ 生物發光法在國外已被廣泛地運用于食品中菌落總數的測定。
  3 MTT法
  3.1 MTT法檢測原理
     檢測原理為活體微生物線粒體中含有琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT（噻唑藍）還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。Formazan結晶形成的量與活菌數成正比。用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活菌細胞數量。
  3.2 應用實例1：巴氏消毒奶中活菌素快速檢測
    取巴斯消毒奶10mL ，至于無菌離心管中3000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入10mL無菌生理鹽水洗滌離心管，再次3000  rpm離心5分鐘，棄去上清取出奶液基質。加入1mL生理鹽水重懸底部的微生物，取0.2mL到96孔酶標板中，同時加入標準菌液做標準曲線，統一加入底物反應30分鐘，讀數。 3.3 該方法的特點：檢測快速，靈敏度高。
  4 流式細胞術
  4.1 流式細胞術檢測原理   檢測原理：細胞經特異熒光素標記后，通過激光照射，產生特異熒光信號，通過對這些熒光信號的檢測和定量計算出菌群總數。        4.2 特點：快速、便捷結果可靠、便于操作。
  結語

   菌落總數是微生物檢測中最常見的項目，在檢驗的每一個環節都應該小心謹慎，精準操作，確保檢測結果的準確度。國標法采用的平板計數法是我們最常用的檢測方法，但是操作過程較為復雜，時間較長；而其他方法操作簡便，省時，但是有的成本相對較高，并且有的只針對特定的食品種類。我們應該積極關注新的科學技術在檢測方法中的應用，讓檢測更加精確、經濟、便捷和可靠。