菌落PCR分析克隆的重組體實驗

菌落

溴化乙錠 Taq 延伸 PCR 添加劑 Tween20 10% 溶液dNTP 溶液 PCR 緩沖液 熱穩定 DNA 聚合酶 引物

無菌槍頭 瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

溴化乙錠

Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)

Tween20，10% 溶液

2. 酶和酶緩沖液

dNTP 溶液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 25 mmol/L)

PCR 緩沖液，10X, 用戶買熱穩定聚合酶時公司一并提供，或者 PCR 優化緩沖液，比如，Opti-Prime PCR 優化試劑盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)

熱穩定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)

3. 核酸和寡核苷酸

可選擇：插入物特異的引物（在雙向克隆中用來確定插入物的方向）

一套篩選重組體的引物

4. 專用設備

用于劃板和接菌的無菌槍頭

用槍頭代替牙簽，是因為牙簽可通過毛細作用帶走液體，因此會改變反應混合物的濃度。

5. 額外項目

瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑，包括溴化乙錠

二、方法

1. 根據反應數目或要做的 PCR 反應的管數，在冰上用一個離心管像調雞尾酒一樣準備

PCR「雞尾酒」式混合物，按如下順序依次加入各種成分。

H₂O 將終體積補充到 25ul

Taq 緩沖液，10X                                                          2.5ul

Tween20(體積分數 10% 溶液）                                   1.0ul

dNTP 混合物（每種 dNTP 為 25 mmol/L)                     0.2ul

重組體篩選引物套（100ng/ul)                                     1ul

Taq 延伸 PCR 添加劑（5U/ul)                                     0.25ul

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)                                              0.25ul

2. 在冰上，分裝"雞尾酒"式 PCR 混合物到每一個 PCR 試管中，每管移取 25ul。

3. 對照反應中，加入 1ul 的非重組 DNA。
可以選擇：對于用來確定插入方向的反應，向恰當的反應管中加入第三個插入物特異的引物。

4. 對于重組篩選，用一個無菌槍頭刺挑一下轉化后長出的菌落，然后在相應的反應管中攪動菌落物質。在給每一個反應混合物接種后，迅速地移走槍頭，并在含有抗生素平板上輕涂以留菌種，以備后續分析。對于 PCR 介導的重組篩選，也可參考下面的疑難解答。

5. 輕輕混勻每個反應體系。

6. 用推薦的循環參數進行 PCR。

7. 用標準的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。推薦用 10~15 g/L 瓊脂糖凝膠來優化分辨500~6000bp 的 PCR 產物。通常，取 1~5ul PCR 產物經溴化乙錠染色后分析。可以通過傳統的瞬間成像技術或計算機圖像軟件來獲取圖像。

1.  設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。

2.  使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的循環數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環降0.2度左右。

牙簽可通過毛細作用帶走液體，因此會改變反應混合物的濃度。