螢光生成反應通常分為以下兩步：
螢光素 +ATP→ 螢光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） +PPi
螢光素化腺苷酸 +O2→ 氧螢光素 +AMP+ 光
這一反應非常節省能量，幾乎所有輸入反應的能量都被轉化為光。與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈，只有約10%的能量被轉化為光，剩余的能量都變為熱能而被浪費。
螢光素或螢光素酶不是特定的分子，而是對于所有能夠產生螢光的底物和其對應的酶的統稱，雖然它們各不相同。不同的能夠控制發光的生物體用不同的螢光素酶來催化不同的發光反應。最為人所知的發光生物是螢火蟲，而其所采用不同的螢光素酶與其他發光生物如熒光菇（發光類臍菇，Omphalotus olearius）或許多海洋生物都不相同。在螢火蟲中，發光反應所需的氧氣是從被稱為腹部氣管（abdominal trachea）的管道中輸入。一些生物，如叩頭蟲，含有多種不同的螢光素酶，能夠催化同一螢光素底物，而發出不同顏色的螢光。螢火蟲有2000多種，而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關昆蟲）則有更多，因此它們的螢光素酶對于分子系統學研究很有用。如今研究得最透徹的螢光素酶是來自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinus pyralis）。