葡萄糖氧化酶生產的發酵工藝

培養基組成、發酵條件的控制及發酵工藝設備等都是直接影響發酵效果的主要因素。碳源和氮源是培養基中對菌種發酵的兩個最基本影響因
素。不同的菌種對碳源有特異的選擇性[14]。一般工業生產中選用葡萄糖作為GOD菌株的碳源，葡萄糖是GOD最主要的誘導物。也有一些霉菌在以蔗糖、麥芽糖、木醇糖、果糖等作為碳源時，其反應也很活躍，Semashko等研究了3個青霉菌的突變菌株funiculosum BIMF-15.3、MM95.132和46.1均能在分別以葡萄糖、木醇糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和甘露醇作為碳源的培養基上生長并產生GOD，且在以葡萄糖、蔗糖、果糖為碳源的培養基中GOD 的產量較高， P. funiculosumBIMF-15.3在以木醇糖或甘露醇為碳源時產酶反應活躍，而P. funiculosum 46.1在麥芽糖為碳源時產酶反應活躍。

碳源的初始濃度也會影響霉菌GOD的合成。初始碳源濃度約為8%時適宜GOD合成，濃度過低或過高都會降低產酶水平，初始碳源濃度降低，會影響菌體生長；濃度增大，會因代謝產物大量生成而形成阻遏作用。相對于碳源，菌種對氮源的選擇特異性沒有那么嚴格。氮源分為有機氮源和無機氮源，有機氮源包括蛋白胨、玉米漿以及麥芽浸粉等；無機氮源主要為硝酸鹽和銨鹽。研究表明，將無機氮源與有機氮源聯合使用比使用單一氮源效果要好[17]。發酵過程是一個復雜的反應系統，影響因素包括培養基初始pH、接種菌齡與接種量、溫度控制、發酵時間、搖瓶轉速與溶氧量及鈣離子添加量等。GOD在pH為5~6時具有較好的穩定性，且活力較高，尤其是在pH約為5.5時，酶活達到最高，pH<4.5或>6.5時，酶活均呈下降趨勢。適宜接種菌齡一般選擇在對數生長期的后期，即培養液中霉菌量接近高峰的時間段內，過早或過遲接種都對菌種的發酵不利。菌種接種量在菌液黏度及溶氧量等條件允許情況下，接種量越大越有利于提高發酵效率，但過大會影響產物的生成。黑曲霉的最適發酵溫度為30~31 ℃，青霉最適發酵溫度較低，為26~29 ℃，且前期霉菌生長所需溫度略高，后期GOD合成所需溫度略低。研究表明，將黑曲霉菌種在25~37 ℃進行產酶培養，培養溫度為30~35 ℃， 尤其在30 ℃為最好， 經多次試驗發現，如果在培養開始15~20 h將溫度固定在30~35 ℃，之后降至30~31 ℃，產GOD量最高，產酶量將增加3~4倍。不同菌種達到最大產酶量的發酵時間各不相同。霉菌是需氧菌，在菌株生長及產酶過程中都需要足夠的溶解氧，但溶解氧也不是越多越好，研究表明，培養基中稍低濃度的溶解氧可以促使高活性的GOD 生成，若溶解氧過高，胞內GOD 的生成速率雖高，但可利用的葡萄糖很快被氧化為葡萄糖酸，幾乎無剩余的葡萄糖和足夠的時間獲得較高活性的酶。酶產量與搖瓶轉速與空氣流量、溶解氧以及菌體耐受程度等因素有關。適宜低濃度的鈣離子對GOD的合成有促進作用。

一般在培養基中添加一定量的CaCO3，不溶性的CaCO3不僅可以提供低濃度的鈣離子，還可作為菌株的生長載體。研究表明，控制培養基中CaCO3濃度在約35 g·L-1時，對霉菌發酵產GOD的促進作用最為明顯。發酵工藝設備的設計是否合理也直接影響到發酵效率的高低。在GOD發酵過程中引進一個帶有膜過濾器的外循環系統，結果膜過濾發酵GOD產生速率比分批發酵提高約3倍，且能在較長時間內維持較高的產酶率。