蔡宗葦：質譜成像前景廣闊分子水平探索生命奧秘

　　分析測試百科網訊 去年底英國分析科學家網站評選的2020年度全球最具影響力的60位分析化學家榜單中，香港浸會大學蔡宗葦教授獲得殊榮。蔡教授在環境和生物分析領域造詣深厚，并擅長質譜基礎理論與應用研究，近年來在大熱的質譜成像領域做出多項前沿性的探索，并應Wiley邀約發表了關于復雜體系三維定量質譜成像的系統性綜述。近日，分析測試百科網采訪到蔡宗葦教授，他結合自己的工作介紹了質譜成像的進展，并展望了未來的挑戰和機遇，期望對所有關注質譜成像前沿領域的研究者們有所幫助。

香港浸會大學化學系講座教授、環境與生物分析國家重點實驗室主任 蔡宗葦教授

質譜分析為主 三大研究方向

　　蔡宗葦教授首先簡單介紹了環境與生物分析國家重點實驗室，這是香港浸會大學唯一的一所中國科技部批設的國家重點實驗室，結合其在持久性有機污染物（POPs）分析方面的多年研究經驗和良好基礎，通過與生物科學、環境科學和材料科學等交叉與滲透，建立以蛋白質組學、代謝組學、生物傳感和生物成像為重點的生物分析平臺，瞄準POPs環境與健康研究的國家需求和學科前沿，提出環境和生物體中POPs的分析測試新原理，建立分析測試新方法、新技術，研制新型檢測儀器或裝置，為提高國家環境品質和健康水準，以及履行國際公約提供重要的科學和技術支撐。

環境與生物分析國家重點實驗室

　　蔡宗葦教授表示，環境與生物分析國家重點實驗室共有三大研究方向，一是持久性有機污染物環境行為的分析和研究，包括遷移、變異、降解等；二是持久性有機污染物相關的人體健康疾病等研究；三是質譜方面的分析方法開發和分析儀器開發。

　　 “我們是一個以質譜分析為主的實驗室，近幾年的研究方向除了蛋白質組學、代謝組學等多組學研究以外，更關注于開發質譜成像技術，特別是將質譜成像相關技術應用于環境污染和毒理研究。”談到質譜成像技術，蔡教授表示，“我們的研究對象，既包括污染物的相關生物標志物代謝分析，也包括生物體內的內源性代謝物成像分析。”

　　蔡教授舉了兩個例子。乳腺癌可能是由于內分泌干擾物在動物體內長期暴露引起了乳腺癌的增殖、增發和惡性過程，課題組開展的乳腺癌質譜成像研究發表在《色譜》和Journal of Hazardous Materials期刊^[1,5]上。另一個例子是關于孕鼠妊娠后暴露于PM2.5環境下的整個過程的質譜成像分析。區別于傳統環境毒理學的研究方法，研究結合質譜成像和組學技術以及分子生物學技術，分析了妊娠期PM2.5對子代鼠認知和情緒發展的影響，為探索跨代際PM2.5毒性與神經退行性相關疾病的研究提供了重要信息。該研究對孕鼠組織、胎盤，孕鼠生產的小鼠進行生物分析、質譜成像分析，尤其對大腦組織進行質譜成像。研究發現在PM2.5長期暴露以后，污染不僅會從母鼠傳遞到子鼠，還會對小鼠的行為學產生影響，尤其對雌鼠更明顯。通過3種行為學測試，發現PM2.5的暴露對孕鼠生產的小鼠的認知行為情緒影響非常大，甚至妨礙了大腦組織。因此，研究團隊假在設研究對象后，對小鼠大腦里的生物標志物成像，基本可以獲得污染物相關的生物標志物和毒性作用的靶器官,該研究已發表于Science Bulletin [2]。目前，課題組還在進一步研究神經行為學影響情緒行為的機理。

代表性脂質小分子(SM (d44:1))在小鼠組織中的空間分布: (a) 完整胎兒3D質譜成像； (b)胎兒2D質譜成像； (c) 成年子代小鼠腦成像

　　課題組還開發了一些創新的質譜成像方法，研究如3D細胞球里的污染物分布和空間分布；污染物在3D細胞里所引起的毒性，造成的生物標志物變化等。除了開發質譜分析方法外，課題組還開展一些對疾病、尤其是污染物引發的疾病和人體健康的研究。

質譜成像發展的源動力

　　兩大特征

　　蔡宗葦教授總結了質譜成像的幾大特征。首先，同其它成像方法不同，質譜成像（MSI）是一種分子水平上的成像技術，通過研究生物體整體的代謝組、脂質組和蛋白組的變化，用直觀可視化的形式展現結果。由于質譜檢測的是分子離子，質譜成像具有非常大的發展空間，其主要的分析對象是一些化學物質的代謝，不管是代謝物，還是污染物，以及與代謝物相關的蛋白或是DNA/RNA等，對其進行精準的定量和定位。

　　其次，質譜成像具有高通量、高靈敏度、免標記的特征。免標記非常重要，醫學上很多檢測需要熒光或者加一些顯色劑標記，而質譜成像不需要標記，除非是為了更好的檢測做的特殊化學標記。“對于2D和3D器官組織的分析，以及我們課題組開發的3D細胞球的技術，質譜成像已廣泛用于細胞組織和人體腫瘤組的生物小分子、大分子甚至金屬離子的定性定量。”蔡宗葦接著說，“金屬離子成像也是一個非常重要的方向，但我們現在的儀器還檢測不到，要測金屬可能要連接到ICP-MS，或者Cell metric那種更高端的成像儀器。”

　　面臨挑戰：任重道遠

　　蔡宗葦教授也談到了挑戰：“質譜成像雖然發展很快，涌現很多NCS好文章和綜述文章，但我個人認為尚處于初級階段，還有很多明顯的限制。比如小分子代謝物的成像分析、組織體內的成像分析，目前比較成熟的方案限制于脂質Lipid，雖然一些高端研究中特別好的結果也展示了其可分析多肽、蛋白和其它代謝物，但質譜成像用于蛋白常規分析的前路還很長。基礎研究和應用研究方面都需要研究者們繼續改進和發展。我希望儀器公司也能夠配合開展研究，一同不斷發展質譜成像技術。”

　　質譜成像近年來是研究熱點，蔡教授去年發表的關于復雜體系三維定量質譜成像的系統性綜述^[4]，已經被評為高引用率文章，綜述了質譜成像當前的研究熱點和未來的發展方向。簡單來說，目前重要的一大研究熱點探索簡單的樣品處理方法，因為組織處理難度極高。現在很多人做不好質譜成像，主要是因為做不好樣品前處理。樣品前處理包括冰凍、切片、噴基質等環節，樣品處理不好，有再好的儀器也不行，而且還會影響整個檢測的穩定性和重復性。

　　第二是要開發更好的激光采樣的質譜成像技術，這離不開儀器公司的努力。蔡教授認為，現在的分辨率仍是瓶頸。當前幾十微米的空間分辨率，尚不能滿足單細胞成像分析的要求。蔡教授課題組研究了3D細胞球技術，即把大量的細胞聚集在一起，將球切下來分析。提高質譜成像分辨率對生物分析、生命科學分析至關重要。質譜成像預期可應用于實時呼吸系統的吸收，動物體內的生物標志物或藥物分析，研究污染物在體內的轉換、代謝和消除。質譜成像技術可以從整體上研究如從腎到肝等器官之間代謝污染物的變化和轉移、肝臟的代謝過程等。

　　第三是需要能進行大量數據處理的軟件。迄今為止，無論哪家儀器公司的質譜成像分析，進行大量數據分析需要耗時很長，而且一旦做數據處理就可能影響儀器使用，所以需要高效率且好用的軟件。

　　第四是在環境毒理研究方面，希望質譜成像技術可以實時觀察動物、細胞在環境污染物中的暴露過程。當前雖然TOF類氣溶膠質譜已可以監測環境污染物，但還無法進行質譜成像。在此方面，除了對暴露過程進行質譜成像，還需實現質譜成像儀器的小型化。

亞洲首臺！從rapifleX到timsTOF fleX MALDI-2

　　2016年5月，布魯克亞太地區第一臺 rapifleX MALDI Tissuetyper在香港浸會大學環境與生物分析國家重點實驗室順利完成安裝。隨著近日亞洲首臺timsTOF fleX MALDI-2的成功安裝，雙方的合作越來越緊密。

　　布魯克timsTOF fleX MALDI-2的離子源可將小分子和脂質分析的靈敏度提高一到兩個數量級，進一步擴大MALDI質譜與基于MALDI技術的質譜成像應用范圍。timsTOF fleX通過將PASEF與平行反應監測（PRM）相結合，使其非標記定量蛋白質組學性能得到了進一步增強，提高了多肽離子的選擇性和靈敏度，增加了靶標離子的數目。

環境與生物分析國家重點實驗室質譜成像實驗室

　　蔡宗葦教授回顧和布魯克合作的經歷時表示，自己是布魯克autoflex的早期用戶，曾嘗試過成像分析，2016年購置Tissuetyper后開展質譜成像研究并發表了系列文章。這次購置的是配置nanospay離子源、離子淌度和MALDI-2的timsTOF fleX MALDI-2。

布魯克timsTOF fleX MALDI-2

　　在這套強悍配置的儀器上，蔡教授有幾大期待。首先，希望其在進行蛋白質組學研究時具有更高的靈敏度，因為PASEF的離子利用率極高并配置了nanospray源。

　　其次，開展離子淌度的分析。蔡教授表示：“我本人尚未體驗過離子淌度，但我非常喜歡這項重要的質譜三維分離技術。期待它能幫我開展許多以前無法實現的質譜分析，特別是同分異構體的分析，其中包括有機物、生物標志物、脂質，比如很多lipids有支鏈、直鏈、開鏈的差別，今后預期可以區分它們。還希望借助離子淌度開展一些基礎性研究，特別是尚未報道過的特殊的脂質（Specific lipids），它們也許是人類健康所需，也可能是生物體中最重要的生物標志物。”

　　第三，最期待的是開展更好的質譜成像工作。比如對于Lipid的成像，2個激光預期可獲得更好的靈敏度，而數百個Lipids中的同分異構體可以用離子淌度分離。更重要的是MALDI-2的成像分辨率更高。據文獻報道^[3]，透射模式t-MALDI-MSI的空間分辨率可達到1μm或更小，這種無標記方法可以表征（亞）細胞水平上的組織和細胞中化合物的空間分布。但是，該技術的主要局限是小像素尺寸下離子豐度會降低。MALDI-2是一種能提高脂質和代謝物離子豐度并擴大化學覆蓋范圍的有效方法。將兩種技術結合，應用于組織和細胞的脂質檢測，可以實現高空間分辨和高通量的質譜成像分析。

　　除了對硬件性能的期待，由于未購買所有的軟件，蔡教授也期待布魯克在軟件方面提供更多的支持。“當年我們購置Tissuetyper是亞洲第一臺，之后我做長江學者工作的廣東工業大學也買了2臺；這次購置MALDI-2又是亞洲第一臺，聽說又有兩家訂了，他們也曾向我咨詢。”兩次作為最新款產品的亞洲首個用戶，蔡教授對于產品初期的使用和反饋對企業都有極大的幫助。

　　在應用方面，蔡教授希望MALDI-2在小分子的質譜成像方面發揮更大的威力，包括前文介紹的小分子生物標志物、內源性代謝物、脂質等。蛋白的質譜成像分析一直非常困難，需在組織上進行，選擇抗體后再酶解分析。“分析一個豐度非常高的蛋白當然沒有問題，但是經常是沒有意義。真實的需求是要分析在組織中幾千個蛋白中、低豐度的、有意義的那些蛋白。我很期待新的儀器能夠開展一些蛋白的成像分析，可借助布魯克或其它公司開發的軟件計算分析。”

高水平工程師的大力支持

　　蔡宗葦教授非常感謝布魯克在研究方面提供的支持：“當時我們的rapifleX MALDI Tissuetyper是亞洲第一臺用于實驗室科研的。布魯克日本的工程師Takashi Nirasawa給了我們很多技術建議，幫助我們解決了初期的許多問題，尤其在小鼠乳腺癌分析方面。”

　　今年，蔡宗葦課題組在Journal of Hazardous Materials（9.038/Q1）^[5]上發表論文，探討了環境中典型內分泌干擾物雙酚A(BPA)及其替代品雙酚S(BPS)的暴露與乳腺癌發展密切相關的分子機制。研究以環境相關暴露劑量的BPS處理乳腺癌裸鼠移植動物模型，采用脂質和蛋白的質譜成像結合分子生物學的方法，對相關的分子機制進行初步探索。研究發現乳腺腫瘤體積隨BPS暴露濃度升高呈減小趨勢，并發現了腫瘤異質性驅動的增殖和惡性病變機制。其中，蛋白的質譜成像方法采用原位酶解法，并構建了人乳腺癌相關的數據集進行質譜成像蛋白圖像的比對和搜索。

BPS誘導乳腺腫瘤增殖和惡變的分子機制

　　蔡宗葦教授強調：“即使我們擅長質譜分析，剛開始對質譜成像也是一知半解，僅靠看文獻和看書是非常困難的。布魯克工程師給予我們很多幫助，使我們能夠能夠盡快上手。在這篇研究文章中，為了感謝這位日本工程師Takashi Nirasawa，我們還將他列為共同作者。”

　　另一項工作發表于2018年Anal. Chem.^[6]上，將MALDI-TOF rapifleX (Tissuetyper)質譜成像儀和生物分析方法相結合，研究雙酚S暴露小鼠的腎臟毒性，從雙酚S引起的脂質分子空間分布特異性來深入探討污染物的毒性作用機制。文章末尾也致謝了布魯克，尤其是其在提供軟件方面的幫助。

需要專業性的培訓和討論

　　蔡宗葦教授也就促進質譜成像技術的發展和應用發表了個人的看法：針對這一研究熱點，要多組織專業性的訓練和討論，防止買了儀器卻不會用的現象。比如，舉辦質譜成像相關的學術會議，促進交流和學習；也需要儀器公司花精力組織培訓，比如借助某個學術會議組織會前workshop，甚至將儀器安裝在現場進行指導訓練，這對質譜成像技術在中國的發展和應用很重要。

　　參考文獻

　　1.質譜成像技術及其在乳腺癌研究中的應用.色譜, 2021, Vol. 39?? Issue (6): 578-587.DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.10005

　　2.Airborne fine particulate matter induces cognitive and emotional disorders in offspring mice exposed during pregnancy. Science Bulletin, Volume 66, Issue 6,30 March 2021, Pages 578-591

　　3.Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. M. Niehaus, et al. Nature Methods，volume 16, pages925–931(2019).

　　4.Three‐dimensional quantitative mass spectrometry imaging in complex system: From subcellular to whole organism. Mass Spec Rev. 2020；1–19.

　　5.Breast cancer proliferation and deterioration-associated metabolic heterogeneity changes induced by exposure of bisphenol S, a widespread replacement of bisphenol A. Journal of Hazardous Materials. Journal of Hazardous Materials, Volume 414,15 July 2021, 125391

　　6.MALDI-MS Imaging Reveals Asymmetric Spatial Distribution of Lipid Metabolites from Bisphenol S?Induced Nephrotoxicity. Anal. Chem.2018, 90, 5, 3196–3204