薄層層析分離支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質與適用范圍；二是支持劑的顆粒大小。一般來說，所選吸附劑應具有zui大的比表面積和足夠的吸附能力，對待分離的不同物質應有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力。所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會發生化學反應。吸附劑必要時用離心機進行預處理。
吸附力的強弱規律如下：吸附力與兩相間界面張力的降低成正比。某物質溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質，非極性吸附劑易吸附非極性物質。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向。
一、支持劑的性質與適用范圍：
1、硅膠：
硅膠是應用最廣泛的一種吸附劑，主要優點是化學惰性，具有較大的吸附量，易制備成不同類型、孔徑和表面積的多孔性硅膠。硅膠的吸附活性取決于含水量，吸附層析一般采用含水量10%～12%的硅膠，含水量小于1%的活性最高，含水量大于20%時活性最低。
硅膠適用于分離酸性和中性物質，堿性物質能與硅膠作用，如用中性溶劑展開，堿性物質有時留在原點不動或者斑點拖尾，而不能很好地分離。為了使某一類化合物得到滿意的分離，可改變硅膠的酸堿性。
使用硅膠和硅藻土時，通常要先加入粘合劑再在支持板上涂布。常用的粘合劑有煅石膏和淀粉。用煅石膏為粘合劑的薄層易從玻璃板上脫落，但可適用腐蝕性試劑。加淀粉制成的薄層，機械性能較好，但不宜用腐蝕性強的試劑。
2、氧化鋁：
氧化鋁是微堿性吸附劑，適用于親脂性物質的分離制備，具有較高的吸附容量，價格低廉，分離效果好，應用較廣泛。
使用氧化鋁作吸附時，要注意選擇適當活性及適當酸堿度的產品。
3、聚酰胺：
可分離多種化合物，在蛋白質或肽的N末端殘基分析中是比較理想的分離方法。
4、硅藻土和纖維素：
硅藻土和纖維素是中性支持劑，需在吸附水、緩沖溶液或甲酰胺等后才能用于薄層層析分離。
二、支持劑的顆粒大小：
用作薄層層析分離支持劑的顆粒要求大小適當、均勻。顆粒過大，展開時溶劑推進速率太快，分離效果不好。顆粒太小，展開太慢，斑點拖尾不集中，分離效果差。顆粒大小固定在一定范圍內且薄層厚度均勻一致時，遷移率可保持恒定。無機支持劑的顆粒為150～200目，薄層厚度為0.25～1mm較合適。有機支持劑的顆粒為70～140目，薄層厚度為1～2mm較合適。