一、組織蛋白的裂解提取：
1.分別取-70℃保存的各組動物的樣品（半個腦、0.5g肌肉），放入小離心管中，在冰浴上以PBS充分洗滌2次，除去殘留血液。
2.用無菌手術剪和鑷子將大鼠肌肉剪碎（腦樣品不用剪碎），放入另一小離心管中，于0℃以PBS充分洗滌，4℃，3000 rpm離心5分鐘。
3.吸出上清夜，盡量將管壁上的液滴吸凈，將組織碎片轉移至組織勻漿管內。
4.取2ml的裂解緩沖液（預冷至0℃），加入20μlAprotonin,20μl Trypsin，20μl NaoN4,20μl的PMSFb,20μl的leupeptins和2μl的DTT，混勻后加入勻漿管內，在組織勻漿器上冰水浴勻漿，注意轉速不?0000 rpm。4℃放置2h，10000 rpm 4℃ 離心10分鐘(可延長)，吸取上清液（蛋白液）-20℃保存。
二、蛋白的含量測定—染料結合法
（一）基本原理：考馬斯亮藍G-250(CBBG-250)具有紅色和青色兩種色調，在游離狀態下呈紅色型，一旦與蛋白質結合就變為青色，色素的最大吸收波長從465nm移到595nm，測定595nm處光密度值的增加即可進行定量。
（二）標準曲線的繪制：
分別在5個1.5ml appendoff管中各加入1μg/μl的BSA 0、1.25、2.5、5、10μl，以0.15mmol的NaCl補足至100μl，每管各加入考馬斯亮藍染料溶液1ml，室溫放置2min。用1cm光徑的微量比色杯測量，取A595吸光度值對標準蛋白濃度作圖，畫出標準曲線。
（三）樣品中蛋白含量的測定：
將裂解液作二十倍稀釋后，按照標準曲線測定待測樣品的A595，從BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。
三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
（一）在蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，SDS和蛋白以1.4:1的比例結合形成復合物，確保蛋白質的解離狀態，并盡量減少多肽亞基間的聚合。這種凝膠電泳的特點是可以對樣品進行濃縮，并具有分子篩效應，因而大大提高了樣品的分辨率。
（二）試劑：
1. 30%丙烯酰胺溶液：29%（w/v）丙烯酰胺1%（w/v）N,N-亞甲雙丙烯酰胺,溶于去離子水，室溫下棕色瓶中避光保存。
2. 1.5mol/l Tris? Cl( PH 8.8):取91g的Tris base加水至近500ml，用濃HCl調節PH至8.8，室溫保存。
3. 1.0 mol/l Tris? Cl( PH 6.8):取30.5g Tris base 加水至近250ml，用濃HCl調節PH至6.8，室溫保存。
4. 10% 過硫酸銨:去離子水配制，配10ml，4℃保存，一周內使用。
5. 加樣緩沖液：2%SDS 50mMOL/L Tris?Cl（PH6.8） 10%甘油 50mMOL/L DTT 0.1%溴酚藍
6. 電泳緩沖液：25mmol/ltris.cl( PH 8.0) 25mmol/l甘氨酸 0.1% SDS( PH 8.3)
(三)操作步驟：
1.配制分離膠（8%，10ml）：
去離子水4.6ml ; 30%丙烯酰胺溶液2.7 ml ; 1.5M Tris（PH 8.8）2.5 ml ; 10% SDS 0.1 ml ; 10%過硫酸銨0.1 ml ; TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）0.006 ml
2.加入TEMED以后，迅速混合并灌注在膠板內，注意留出灌注成層膠所需空間（梳子的齒長再加1㎝）。用水封膠。室溫下（約20分鐘）聚合。
3.聚合后棄去水封，用濾紙吸干。
4..配制積層膠：
去離子水2.7ml ; 30%丙烯酰胺溶液0.67 ml; 1.5M Tris（PH 6.8）0.5ml; 10% SDS0.04ml; 10%過硫酸銨0.04ml ;TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）0.004 ml
5.先插入梳子，然后加入TEMED混勻后立即在聚合的分離膠上灌注積層膠，小心避免混入氣泡，凝膠垂直放置于室溫下（積層膠聚合的同時，把樣品和加樣緩沖液混合，100℃加熱3min使蛋白質變性）。
6.成層膠聚合完全后 (20分鐘)，小心移出梳子，把凝膠板轉移至電泳裝置上,準備上樣。
7.上樣：小心將微量加樣器插入樣品孔上方，輕輕推入樣品40μl，防止注射器內氣泡進入孔內（Maker加20μl）。
8.電泳：將垂直電泳槽中加入電泳緩沖液（液面中間高于兩邊）。接上電源開始電泳。開始電壓50V，當染料進入分離膠后（約0.5h），電壓增加到100V，繼續電泳至溴酚藍到達分離膠底部后切斷電源（約2h）。
9.取膠：用刮勺撬開玻璃板，取下凝膠用于Western blot分析。
四、Western blot分析
（一）基本原理：Western blot是針對蛋白質產物的一種較靈敏的檢測方法。它把凝膠電泳分離后的多肽從凝膠轉移到固相支持物，并用針對特定氨基酸的抗體做為探針進行檢測，可檢測出1ng~5ng的蛋白。
（二）試劑：
1.轉移緩沖液：39mmol/l甘氨酸；48mmol/lTris.Cl；0.037%SDS。
2.封閉液：5%脫脂奶粉；0.01%防沫劑A；0.02%疊氮鈉；溶于PBS中。
3.麗春紅S染液：0.1g麗春紅S；0.1ml乙酸，加水至100ml。
4.封閉液：5%（W/V）脫脂干奶粉；25mM Tris （PH 8.0）；12.5mM NaCl；0.05% Tween-20，配成1000ml