用蛋白A／G-瓊脂糖
備擇 用GST融合蛋白
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 全細胞抽提物 |
| 試劑、試劑盒 | 抗體 免疫共沉淀緩沖液 氯化鈉 蛋白 A G-瓊脂糖漿 2 × 樣品緩沖液（用于 SDS-PAGE 膠） |
| 儀器、耗材 | 20 ml 注射器和 18-G 針頭 漢密爾頓注射器 |
| 實驗步驟 | 1. 在冰上將以下組分加入離心管，雙份： 0.5～1 mg 全細胞抽提物 1 μg 抗體 5 mol/L NaCl 平衡到終濃度 100 mmol/L NaCl 免疫共沉淀緩沖液到 0.5 ml 終體積 2. 輕輕翻轉離心管數次，冰上孵育 90 min。中間偶爾翻轉離心管。 3. 4℃ 下最大速度離心 10 min，沉淀非特異性聚集。轉移上清到新的離心管中。 4. 加 50 μl 蛋白 A 或蛋白 G-瓊脂糖漿（25～30 μl 珠子體積）。確保在加到樣本中之前瓊脂糖漿均勻懸浮。 5. 4℃ 下旋轉離心管 30～60 min。 6. 4℃ 下 1000 r/min，離心 30 s，以聚集蛋白 A/G-瓊脂糖。 7. 使用 1 ml 免疫共沉淀緩沖液洗沉淀 3 次。每次洗時，離心前輕輕的翻轉離心管 3 次。每次離心后，使用 20 ml 注射器和 18-G 針頭吸氣并去除上清。 8. 最后一次盡可能在不接觸珠子的情況下吸盡所有的液體并加入 25 μl 2 × 上樣緩沖液。 9. 沸水煮 5 min 準備 SDS-PAGE 電泳分析，振蕩器混勻，低速離心聚集珠子。使用漢密爾頓注射器加樣到 SDS-聚丙烯酰胺膠上。安排兩份重復樣本以預備雙份的免疫印跡。電泳分離。 10. 分別使用兩個不同的蛋白質的抗體作免疫印跡分析。確保包含全細胞抽提物作為比較及免疫印跡的正對照（圖 19.5.1）。 |