28) 首先我想問一下agarose和sepharose區別,我的理解是:都指瓊脂糖,但agarose是未連接其他介質的,而sepharose是連接其他介質的,不知理解對不對?請指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一種東西嗎?
其次,我想問一下你純化過GST融合蛋白沒有?我現純化一個融合蛋白(某種酶和GST融合),我買了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆說直接將親和介質于細菌裂解液混允離心....我不知我買的可不可以這樣做.而產品說明書上說做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,裝介質的柱子的高度和直徑有要求嗎?
agarose是通常的瓊脂糖的英文名稱，大家都這么叫，它不是商品的注冊名稱。而sepharose是amersham的瓊脂糖凝膠的注冊商品名稱。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是瓊脂糖凝膠，而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一類東西，只是廠家不同。
GST融合蛋白純化過，5ml的凝膠你可以裝在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取決于你的喜好和方便。1ml不好裝，除非有專門的小柱子，對于直徑和高度沒有特別的要求，我們的做法是：
1、 GST瓊脂糖凝膠FF裝柱，0.7X2.5cm，柱床體積為1ml；
2、 用緩沖液1平衡5個床體積，流速為1ml/min；
3、 將10ml發酵液用緩沖液1稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；
4、 用緩沖液1再洗10個床體積，流速為1ml/min；
5、 用緩沖液2洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰
6、 用純水洗5個柱床體積，再用20%的乙醇洗5個柱床體積，流速為1ml/min，柱子置于+4~8℃環境中保存
緩沖液組成：
緩沖液1：20 mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
緩沖液2：50mM Tris-鹽酸緩沖液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 鹽酸29.2ml，307mg還原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 請問con A sepharose 4B 親和凝膠使用前的處理方法？
不需要特別處理，直接平衡后就可以上樣了。
30) 謝謝，我想問一下，是不是離子交換必須要線形梯度洗脫比較好呢？還是階段洗脫好？檢測器我想先收集然后再去測紫外。
也不是,有的時候階段洗脫效果就很好,而且容易放大,不需要儀器,我比較喜歡,效果差不多,但是很省事.但是關鍵是容易重復.紫外分管測定那也可以,我上學也那樣做過.
31) 我要從總蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠來源的NF1單抗與兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose來做免疫沉淀，發現做完后跑電泳，出現了兩條帶，分別位于85KD、55KD左右，請問這會是什么東西？會是抗體嗎？還有沒有可能是目標蛋白變小了？
抱歉,我沒有做過免疫沉淀,但是抗體做過一些,抗體重鏈沒有大到85KD的地步,所以應該不是抗體.會不會你的蛋白有四個部分構成,分別是兩個85KD和55KD,這樣分子量正好和你的250KD相當,你可以跑非還原電泳看看,是不是還這樣呢.如果不是,那說明是由這兩個部分組成的.都是由二硫鍵連接的.
32) 我提胰蛋白酶，主要參考用張龍翔書里的辦法，先提卵類粘蛋白，首先過SEPHADEX G-25 柱子脫鹽，然后過DEAE纖維素離子交換柱；第二步是用卵類粘蛋白合成SEPHAROSE-4B親和柱。這些層析過程都可以在緩沖液里面加0.02%的疊氮化鈉抑菌嗎？以后怎樣去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用異丙醇或正丁醇或其它的低分子醇嗎？濃度多大為好？
那實驗我知道，你用什么方法活化瓊脂糖呢，胰蛋酶的親和純化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制劑，抑肽酶，苯甲脒類，特別是后面的苯甲脒，可以買到現成的苯甲脒瓊脂糖凝膠，何必自己去提取呢，感覺比較復雜，自己偶聯這些配基也可以，層析過程不需要加0.02%的疊氮化鈉抑菌，盡量不要加，那透析或者除鹽柱子都可以，或者直接上一樣的親和柱子，用不含這個的緩沖液洗，最后洗脫下來就可以了。
最好還是用乙醇，濃度很難說，因為和你的蛋白濃度有關，別的醇用得很少。此外你可以考慮用硫酸銨沉淀，這樣對活性更好些。純化也可以用疏水，因為它在苯基瓊脂糖凝膠柱子上能被吸附，配合硫酸銨沉淀也是不錯的選擇。
33) 樓主,我想問一下phenyl-sepharose CL-4B有沒有濃縮作用,以前有人做過,克也在純化時,濃縮5-10倍,可是,我卻沒有使純化的蛋白濃縮,我想得到濃度較高的蛋白,又想省去濃縮這步,樓主能不能指點我一下,緩沖液的流速以及柱子的選擇上有什么要求,使洗脫下來的蛋白濃度會較高,
親和，疏水，離子交換都可以濃縮樣品，但是離子交換是最便宜的，苯基可以濃縮，但是想有好的濃縮效果，最好用一次洗脫或者階段洗脫的方法，我建議你先用離子交換柱子掛住，然后直接用高鹽洗脫，因為不知道你蛋白的等電點，所以不知道你該選什么柱子。如果樣品含鹽高，那可以用疏水，然后直接用緩沖液洗脫就可以。親和也差不多這樣的。流速沒有太大的要求，柱子看你手頭有什么，離子交換是最常用的。上點樣
34) 我做的是青霉素酰化酶,樣品鹽濃度很高,我是兩步純化,第一步使用氧化鋁物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸銨的ph7.5,0.05mol/L的磷酸緩沖液洗脫的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脫鹽和濃縮,可是效果很差,基本是起不到濃縮的作用.
我做了好幾次,都是這樣,可是前面有人做的時候起到濃縮的作用,我現在卻做不出來,也聯系不上以前做過的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水層析,我現在就這種柱子,我想問的是裝填料的時候用的玻璃柱株高和直徑的比值大的還是小的,洗脫蛋白時會使洗脫的蛋白峰值高一些,謝謝
這個酶純化應該可以用親和的方法做吧,其實只要把青霉素G偶聯到瓊脂糖凝膠上就可以特異用于這個酶的純化.苯基瓊脂糖凝膠濃縮可以,但是除鹽不好,你想濃縮效果好,你可以把硫酸銨的濃度提高到2.5M再掛在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸緩沖液洗就應該可以.你想濃縮的效果好,那盡量用短粗柱子,也就是徑高比大的柱子.這樣擴散少些.此外要用高載量的填料,顆粒細點,起始鹽濃度高點,這樣保證能濃縮好你的樣品.
35) 樓主：這段在用離子交換柱過