蛋白質與多肽激素的放射免疫分析

蛋白質與多肽激素的放射免疫分析

第一節　概述

　　1960年，美國學者Yalow 和Berson 創立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血漿中胰島素含量的測定。這是醫學和生物學領域中方法學的一項重大突破，開辟了醫學檢測史上的一個新紀元。它使得那些原先認為是無法測定的極微量而又具有重要生物學意義的物質得以精確定量，從而為進一步揭開生命奧秘打開了一條新的道路，使人們有可能在分子水平上重新認識某些生命現象的生化生理基礎。其后30年中，內分泌科學的飛速進展，充分證明了這一超微量分析技術的巨大推動力。1977年，這項技術的發明者榮獲諾貝爾生物醫學獎。隨后這一嶄新的技術迅速滲透到醫學科學的其它領域，如病毒學、藥理學、血液學、免疫學、法醫學、腫瘤學等，以及與醫學生物學相關的學科，如農業科學、生態學及環境科學等。放射免疫分析的物質，由激素擴大到幾乎一切生物活性物質。我們放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速發展與普及，對我國生物醫學的進展起著很大的促進作用。

　　一、放射免疫分析的優缺點

　　（一）RIA的優點

　　放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優點。它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，因此能精確測定各種具有免疫活性的極微量的物質。

　　1．靈敏度高一般化學分析法的檢出極限為10^-3～10^-6g,而RIA通常為10^-9（毫微克，ng）、10^-12g（微微克,pg），甚至10^-15g(毫微微克，fg)、10^-18g(微微微克，ag)。

　　2．特異性強由于抗原—抗體免疫反應專一性強，所被測物一定是相應的抗原。良好的特異性抗體，能識別化學結構上非常相似的物質，甚至能識別立體異構體。

　　3．應用范圍廣據不完全統計，目前至少已有300多種生物活性物質已建立了RIA。它幾乎能應用于所有激素的分析（包括多肽類和固醇類激素），還能用于各種蛋白質、腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原以及一些小分子物質（如環型核苷酸等）和藥物（如地高辛、毛地黃甙等）的分析，應用范圍還在不斷擴展。近年來由于小分子半抗原制備抗體的技術有很大的發展，有人預測幾乎所有的生物活性物質，只要其含量不低于RIA的探測極限，都可建立適當的RIA法。

　　4．操作簡便RIA所需試劑品種不多，可制成配套試劑盒；加樣程序簡單一次能分析大量標本，標本用量也少；反應時間不長；測量和數據處理易于實現自動化；RIA屬體外分析技術，對患者無任何輻射危害。

　　（二）RIA的缺點

　　1．只能以免疫反應測得具有免疫活性的物質，對具有生物活性百失去免疫活性的物質是測不出的。因此RIA結果與生物測定結果可能不一致。

　　2．由于使用了生物試劑，其穩定性受多種因素影響，需要有一整套質量控制措施來確保結果的可靠性。

　　3．靈敏度受方法本身工作原理的限制，對體內某些含量特別低的物質尚不能測定。

　　4．由于放射免疫分析是競爭性的反應，被測物和標準物都不能全部參與反應，測得的值是相對量而非絕對量。

　　5．存在放射線輻射和污染等問題。

　　盡管RIA存在以上缺點，但它畢竟是定量分析方法的先進技術。隨著科學技術的進步，放射免疫分析技術將會得到更加廣泛、更加深入的發展。

　　二、基本原理

　　放射免疫分析技術，是把放射性同位素測定與抗原、抗體間的免疫化學反應兩種方法巧妙地結合起來所形成的一種超微量物質的測定方法。

　　RIA的基本原理，是利用標記抗原（*Ag）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）發生競爭性結合。競爭結合反應可用下式表示：

　　在上述反應系統中，當只有*Ag和Ab時，只產生*Ag—Ab復合物，并保持可逆的動態平衡。如反應系統中同時加入Ag,因Ag 與*Ag 免疫活性完全相同，故與Ab具有相同的親合力。當*Ag為一定量、Ab為有限量、Ag 與* Ag 的量之和超過Ab上的有效結合位點時，*Ag –Ab復合物的生成量與Ag 的量之間呈一定的函數關系。即當Ag 量少時，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游離的*Ag 減少。可見*Ag –Ab復合物生成量是受Ag含量制約的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同濃度的標準物和一定量的*Ag及限量的Ab反應，采取一定方法將B與F分開，即可算出該標準物在各濃度下*Ag –Ab復合物的結合百分率（B/T）。

　　這一反應過程，可用以下簡圖（圖8-1）說明。圖中黑圈表示標記抗原，白圈表示非標記抗原，長條代表抗體，每個抗體有兩個結合位點，標記抗原與非標記抗原對抗體有同等的結合能力。

圖8-1 放射免疫分析原理示意圖

　　從圖中可見，當標記抗原與抗體量一定時，結合率（B/B+F）隨抗原量增加而降低。在實際工作中，以B/T的值為縱座標，標準物的濃度為橫座標，繪成曲線，即競爭性抑制曲線，或稱準確曲線。將未知濃度的樣品按同樣條件操作，所得結合率（%）與標準曲線相比，即可查出樣品中待測抗原的濃度。

　　放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知濃度的標準溶液，并各取一定體積；于其中加入一定量的標記抗原和特異性抗體；在一定條件下使之反應平衡后，采取適當方法將B與F分離；分別測量其放射性；繪制標準曲線（圖8-2）。對樣品中抗原的測定，則可在同樣條件下操作，在標準曲線上查得含量。

圖8-2 標準曲線左：橫座標為等份刻度；　右：橫座標為對數刻度

　　由此可見，要成功地進行放射免疫分析，必須解決好以下3個關鍵性技術問題：

　　（1）標記抗原：要求其純度高、免疫化學活性好、比放射性強、用量適當。

　　（2）制備抗體：要求其特異性高、選用的稀釋度適當。

　　（3）分離B與F：理想的分離方法應當是分離完全、穩定可靠、操作簡單、適用范圍廣。

第二節　放射性碘標記

　　在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。

　一、同位素的選擇

　　同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有³H、¹⁴C、¹³¹I和¹²⁵I等。在使用上各有其優缺點，可根據所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇（表8-1）。大多數抗原分子中都含有C、H等原子，所以用¹⁴C或³H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且¹⁴C、³H半衰期長，所標記的抗原長時間放置后仍可使用，這都是其優點。¹⁴C或³H標記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標記物；³H及¹⁴C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較高效率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者，則仍以采用³H或¹⁴C標記物為佳。

表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質

　　大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且放射性碘的半衰期較短，標記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計數器就能獲得較高效率而精確的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優點，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標記物最多。

　　從應用角度來看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其優缺點，可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言，¹²⁵I有較多的優點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象（包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等）的標記，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。

　　二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記

　　要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標記，則標記后必須采取適當的步驟除去雜質，以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質（這時表面上活性可能還是良好的），再經標記反應時所受的損傷，活性就會顯著降低，影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原，還要采用適當方法加以標記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。

　　多肽激素與蛋白質多用碘標記，最常用的是¹²⁵I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（¹²⁵I^-）氧化成的碘分子（¹²⁵I₂），再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標記法，標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團，即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原，在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的，放射性碘無法標記，必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。

　　因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應條件（pH、溫度、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。

　　常用的標記方法有：

　　（一）氯胺T法

　　氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標記方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine--T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。

　　2．方法以¹²⁵I—AVP的制備為例。

　　（1）碘化反應：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振蕩混勻，室溫下反應40s。

　　（2）終止碘化反應：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以終止碘化反應。

　　（3）Bio—Gel P₂層析純化：將碘化反應混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　　（4）放射性測量：測定各收集管的放射性，出現兩個峰，第一峰為¹²⁵I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。第一個峰中計算最高的幾管，留下備用。

　　為了解標記抗原的質量，每次碘標記后應計算出碘的利用率，標記上多少放射性碘，以及每微克抗原結合上多少放射性碘。

　　（5）標記抗原的貯存：經純化與檢查后的標記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存備用，應避免反復凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的，這是因為：一是脫碘，標記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標準曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（40～80cm ）過柱，洗脫后出現3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。

　2．注意事項

　　（1）放射性碘源的選用：無載體的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產物增多（主要是¹³¹I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na₂S₂O₅等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

　　（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽、蛋白質比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　　（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0～20^。C反應20s，碘利用率都已接近或達到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用¹²⁵I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na₂S₂O₅用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na₂S₂O₅一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na₂S₂O₅用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na₂S₂O₅加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。

　　某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。

　　（4）碘化反應體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應前液體的總