（四）磁性分離法
1975年，Hersh報道了用磁化分離技術分離血清狄高辛放免測定的B、F后，受到了廣泛的重視。近年來國內外許多學者對磁化顆粒的制備進行了系統地研究，應用于B與F的分離，并取得了引人注目的進展，使放免的B、F分離不再使用離心，縮短了放免操作時間，便于放免自動化測量。磁性分離的具體原理為血清樣品與標準品中的抗原與磁顆粒上的一定量的抗體反應，產生的抗原抗體磁性顆粒復合物，在磁場作用下沉降，使結合部分與游離部分分離。在磁性分離器上棄上清，進行測量。優點是簡化了操作程序，B、F分離也較完全，穩定性好。
目前常用的磁性分離技術除磁性固相抗體外，還有磁化活性炭吸附分離劑。
（五）固相包被分離法
近年來由于固相技術的研究使其固相所被（埋）技術發展迅速，再有固相包被具有簡便、快速、穩定、不需離心等優點，有逐漸取代液相法的趨勢。
1990年，Causse報告了活化塑料管新技術及生物素結合抗體、親和素標記物的應用，使放免技術對多數微量物質的檢測可達到10-15g級水平，大大提高了放免測定的精確度、靈敏度。
抗體包被：物理吸附法—方法簡便，但包被量低。
價鍵結合法—需要纖維素、瓊脂等固相載體，操作復雜。
Causse活化塑料管新技術，提高了包被量，主要特點是將順丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚體涂布試管，在試管壁形成一層活性薄膜（這種方法操作簡便）。
（六）雙抗體+PEG的分離法
這種分離方法利用雙抗體特異性強、PEG沉淀簡便快速的優點，從而克服了雙抗體時間長、PEG方法非特異結合高的缺點。這一方面是當前分離技術中較理想的一種方法。
這種聯合方法分離方法減少了第二抗體的用量，PEG的最終濃度也只需2～4%，成本較低。這種方法既適用于蛋白質、酶、大分子物質，又適用于小分子肽等半抗原物質。
1991年，北京中國同位素公司北方免疫試劑所采用80年代法國廣泛應用的雙抗體+PEG、再加一定劑量的γ球蛋白（免疫第二抗體時應用的γ球蛋白）的分離劑，溶解于磷酸緩沖液中，pH在7.4左右。這種分離劑推廣應用產生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特異性結合低，時間短（加入分離劑15min后即可離心），受溫度影響小，受到用戶的廣泛好評。
以上方法，要依據反應液中反應物分子量大小，酸堿度等特點，選擇合適的分離方法及分離劑。
第四節 樣品的前處理
樣品的正確收集與處理，是蛋白質及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的樣品與測定項目，其前處理有不同的要求。下面以神經肽測定為例，介紹樣品的前處理方法。
一、腦、脊髓與垂體中神經肽的提取（以大鼠為例）
1．大鼠稱重后，在盡量安靜的情況下，迅速斷頭、取軀干血。
2．盡快取下全腦、脊髓（某段）與垂體，在沸生理鹽水中煮5min，以滅活酶，保持神經肽的穩定。
3．根據實驗要求分出腦區（如小腦、橋延腦、下丘腦、中腦或中央灰質、丘腦、皮層、海馬、紋狀體等與垂體前葉。
4．腦區等稱重。
5．把腦區、垂體或脊髓，分別置于玻璃勻漿管內，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分勻漿后倒入塑料指形管中，在室溫下放置100min，使生物活性物質充分溶解在酸中。
6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。
7．離心，取上清。
8．低溫（-20℃以下）保存待測。
二、大鼠腦神經核團微穿孔取樣方法（以下丘腦為例）
1．大鼠迅速斷頭，取出全腦，置沸生理鹽水中煮5min。
2．將全腦置于取材角度器上，分別于視交叉前和乳頭體后用雙面刀片垂直切斷，取下丘腦塊。
3．將雙面刀片裝在切片機上。
4．將下丘腦置于切片機機載物臺上，腹側向下，并用502膠水固定。在腦塊后方適當放置瓊脂塊以利固定。
5．開動振動切片機，緩慢移動推進器，切片厚400～500μm。用毛筆沾生理鹽水，小心收集切片置于平皿內的生理鹽水中。
6．將腦切片平置于橡皮板上，并在體視顯微鏡下，參照鼠腦立體定位圖譜，確定神經核團位置。
7．選擇相應直徑的穿孔器，分別于兩側核團上垂直插下，然后推出針蕊將所取核團組織放入勻漿器中。
8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分勻漿后倒入放免測定管中，放置100min。
9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，離心（3000rpm/min）20min，取上清液，低溫保存待測。
三、內臟、腫瘤組織中神經肽的提取（以胃粘膜為例）
（1）取下胃粘膜后，迅速稱重置于試管，中沸蒸餾水1ml，在水浴中煮100min。標本在室溫下放置，其中的生物活性物質會被酶降解，所以要立即加熱處理。
（2）冷卻后倒入特殊的勻漿器中，充分勻漿（使用電動攪拌器）。勻漿液倒入塑料指形管中，再用蒸餾水1ml，沖洗勻漿器，并倒入上述管中。
（3）離心，取上清，低溫保存待測。
四、血漿
1．直接測定
（1）加酶抑制劑：準確采全血若干毫升，注入預冷的加有①抗凝劑0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二鈉）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500單位）的塑料指形管中，迅速低溫離心，取血漿低溫保存待測。
抑肽酶有液體的（標簽寫的有每毫升含多少單位）與固體的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800單位）。固體的抑肽酶可用生理鹽水溶解，使之每20μl含500單位。
（2）酸化處理：每毫升血漿加1mol/l HCl 0.2ml，低溫保存待測。測定前加1mol/l NaOH 0.2ml。
以上兩種方法，任選一種即可。
2．間接測定血標本經提取后，可去除蛋白質等干擾因素，并使微量的生物活性肽濃縮，但較費時，成本也高。常用的提取方法有：
（1）柱層析提取法：有多種層析柱可供提取不同的神經肽，其中較為方便的是用Sep-pak C18層析柱提取。主要步驟步：
①柱的預處理：該柱有兩頭，長頭連接注射器，可注入溶液與樣品，短頭為排出口。預處理時注入乙腈10ml。蒸餾水20ml，使柱中的生物膠活化。
②注入樣品（如血漿、腦脊液、腹水、尿等）：樣品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及雜質等吸附在生物膠上。血漿上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用時間。]
③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些雜質。
④洗脫：用7ml酸性乙腈（按容積算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸餾水21ml）作為洗脫劑，注入柱中，把生物活性肽洗脫下來，收集在塑料指形管中。
⑤清洗：用乙腈、蒸餾水清洗柱子，以備后用。
⑥將洗脫液吹干，低溫保存待測。測定時可加入一定量的緩沖液溶解。
Sep-Pak C18柱層析，也可用于制備標記抗原時的層析純化。
（2）加膜藻土提取法：
①抽血：用一次性塑料注射器抽取受試者靜脈血4ml，置于加有肝素（125單位/ml 全血）指形管中。
②分離血漿：在4℃下離心，取出血漿。
③血漿酸化：取2ml血漿，加入1mol/l HCl 0.5ml, 搖勻。
④吸附：加入0.5%藻土懸液2ml，在水平震蕩器上震30min。離心，去上清，留沉淀。
0．5%藻土縣液（Fuller’s earth)的配制：
0.5g Fuller’s earth
0.1g Dextran T70
100ml去離子水
⑤洗脫：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩渦振蕩器上振2min，離心，取上清置于經硅化的玻管中。
80%酸性丙酮的配制：
80ml丙酮
20ml 1mol/L HCl
⑥去脂：加入石油醚1ml，搖勻，脂肪溶解在石油醚中，分層后吸去上層。
⑦干燥：下層液體，置于37℃水浴中，用氮氣（或空氣）吹干。
⑧低溫保存待測。測定時用一定量緩沖液溶解。
（3）有機溶劑提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。將溶劑按一定比例，加入標本內，混勻、振蕩、離心，取上清吹干，冷藏待測。通常在有機溶劑中加入適量的酸。
在這些方法中，以柱層析法最穩定、準確，但成本高，推廣不易。加膜藻土法，提取率較高，但操作復雜、費時。有機溶劑提取法操作方便，成本也低，雖穩定性較差。
五、腦脊液
1．煮沸收集腦脊液時，管子浸在冰水中。收集完畢，立即在沸的水浴中煮5min。離心、取上清；低溫保存，待測。
2．酸化在1ml腦脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；測定時，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。
3．加酶抑制劑
4．柱層析提取
以上方法，任選一種。
六、尿
尿液收集于事先加有適量醋酸或鹽酸的容器中，使pH達4左右，煮沸1～2min，冷卻后離心，取上清，加適量NaOH液，使尿液pH達7.0左右。此尿即可用于直接測定或經提取后再測定。
尿認提取法相同。采用Sep—Pak C18柱層析提取較為方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。
七、胃液
抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，離心，取上清，低溫保存待測。
第五節 放射免疫分析法的建立
一、放射免疫分析的基本試劑
（一）標準品
標準品是放射免疫分析法定量的依據，由于以標準品的量用來表示被涮物質的量，故標準品與被測物質應當化學結構一致并具有相同免疫活性。標準品作為定量的基準。應要求高度純化。標準品除含量應具有準確性外，還應具備穩定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。
按實驗要求，將標準品用緩沖液配成含不同劑量的標準溶液，用于制作標準曲線。
（二）標記物
標記抗原應具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標記一次可較長時間使用，這對來之不易的抗原尤其重要；④標記簡便、易防護。
要準確測量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強度。所選用的標記抗原的量，在使用125I時達5000～15000cpm。
（三）抗體
應選擇特異性高、親和力強及滴度好的抗體，用于放射免疫測定。
根據稀釋曲線，選擇適當的稀釋度，一般以結合率為50%作為抗血清的稀釋度。
（四）B與F分離劑
以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：
活性炭2g（杭州木材廠生產，森工牌732型）
右旋糖酐T200.2g
加0.1mol/L PB 至100ml
電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。