試劑、試劑盒 考馬斯亮藍 G乙酸甲醇Achromobacter 胰蛋白酶 I 三氟乙酸乙腈2-丙醇
儀器、耗材 SpeedVac 型旋轉濃縮器Tween-20UltrafreeTM MC 濾器C18 反相 HPLC 柱
實驗步驟
材料與設備
考馬斯亮藍 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液）
乙酸 (5% 的 10% 甲醇溶液）
甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液）
SpeedVac 型旋轉濃縮器（Savant Instruments,Inc.)
Achromobacter 胰蛋白酶 I〔賴氨酰內肽酶;50ng/ul 的 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)〕
Tween-20〔0.1% 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕
UltrafreeTM MC 濾器（22um;Millipore Corp.)
三氟乙酸（TFA;0.1% 的 50% 乙腈溶液)
C18 反相 HPLC 柱 (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)
乙腈
2-丙醇
操作程序
1) 用 SDS-PAGE 分離待研究蛋白。
2) 凝膠用 0.05% 考馬斯亮藍 G 染色 15~30 min。
3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脫色。
4) 在水中浸泡 10 min。
5) 從凝膠上切下蛋白帶，轉移至微量離心管。切下一段不含蛋白質的凝膠作對照。如必要，可將凝膠切成較小的碎片，使之能容易地沉入微量離心管的底 部。
6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。
7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。
8) 凝膠碎片在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中干燥 2 min。
9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。
10) 各管加最小體積的含 0.1%Tween-20 的 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—剛夠淹沒凝膠碎片即可。
注：凝膠碎片會膨脹, 故重要的是要保證它們仍能淹沒在含去垢劑的緩沖液中。
11) 各管 30℃ 孵育 24 小時。
12) 各管在微量離心機中離心，將各管上清轉移至 22-um Ultrafree MC 濾器內。12000r/min 離心 2 min。保留濾液。
13) 加 1 體積含 0.1%TFA 的 50% 乙腈溶液于各管留下的凝膠碎片中--足夠淹沒凝膠碎片。4°C 孵育 30 min。
14) 重復第 12、13 步操作。合并各樣品的濾液。
15) 樣品在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中旋轉濃縮至體積小于 100 ml。加適量 HPLC 平衡液，制成供 HPLC 分析用的樣品。
16) 用反相 HPLC C18 柱分離消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脫肽段。于 214mn(對肽鍵）和 295nm(對色氨酸）檢測肽段的 UV 吸收。