蛋白質凝膠染色法實驗（三）

尼羅紅蛋白質凝膠染色劑

尼羅紅 (Nile red) 是一種吩囉嗪酮類染料, 當其從水轉入到疏水環境，如 S D S 微粒或蛋白質-S D S 復合物中時，便顯示出強烈的熒光增強作用。尼 羅 紅 不 會 與 S D S 單體發生顯著作用》利用這一特點開發出了一種適合 S D S 凝膠的迅速的不用固定的總蛋白質染色法。該方案要求電泳在非標準條件下進行，即電泳緩沖液 S D S 含 量 為 0. 0 5 % (m /V )，要 低 于 去 污 劑 的 臨 界 膠 束 濃 度 ，而 不 是 通 常 應 用 于 一 維 和 二 維 S D S -P A G E 的 0. 1 %(m/v ) 的 S D S 含量。蛋白質樣品制備要符合規格 (Garn n ,1990a ;1990b )，如 此 S D S -蛋白質復合物在電泳時才會保持穩定, 蛋白質條帶的遷移也被認為是正常的。這種方法簡單快速: 將尼羅紅儲備液 (0.4 m g /m L 保 存 在 D M S O 中）在 水 中 稀 釋 200 倍 ，至終濃度為2 ug/m L , 每塊凝膠加人超過 1 0 倍膠體積的染液 (如 一 塊 5 m L 的微型凝膠需要 50 m L染色液) 并立即充分攪動。染料在水中會快速地沉淀，故最理想的染色應該為 2?5 m i n ，超過這個時間效果也不會增強。染色之后, 用水簡單地清洗凝膠。可用紫外線或綠光光源激發, 蛋白質條帶會出現淡紅色。本法檢測靈敏度與考馬斯亮藍染色法相似。因為沒有 固 定 ，尼 羅 紅 染 色 的 凝 膠 在 隨 后 電 泳 印 跡 轉 移 時 有 較 好 的 轉 移 效 率（ D a b a n ，2001;D a b a n et al.,1991)。染料的沉淀會在凝膠介質中形成高熒光背景，并 且 染 料 對 S D S 膠團的親和性加上染料的不溶性使得該方法不能用于電泳緩沖液中含 0?1 % S D S 的 S D S ^P A G E 。染料的光穩定性也存在問題。

S Y P R O O r a n g e、S Y P R 〇 R e d 和 S Y P R O
Tangerine 蛋白質凝膠染色劑

S Y P R O R e d 和 S Y P R O O r a n g e 蛋白質凝膠染色劑是由 Steinberg 等 (1996a ;1996b )和 H a u g l a n d 等 (I” 7) 描述 的 ，S Y P R O T a n g e r m e 蛋 白 質 凝 膠 染 色 劑 是 由 Steinberg 等(2000b ) 和 Y u e 等 (2003) 描述的，所有這三種染色劑也同樣經 Steinberg 等（2005) 討論過 。這些染色劑含有一個親水官能團、一個芳香族的熒光團及一個脂肪族尾部，使染料既具有良好的水溶性，又具有很強的插人蛋白質-S D S 復合物、S D S 微粒或膜的能力, 非極性環境下還有強烈的熒光增強作用。這些特征，再加上良好的化學和光學穩定性，可使染料以簡便多樣的染色步驟通用于標準緩沖液條件 (〇. 1 % S D S )S D S ——P A G E 后的染色，其檢測敏感度超越了膠體考馬斯亮藍 0 2 5 0 染料。非標準緩沖液條件下 (0.05% S D S ) ，這些
染料與尼羅紅相比染色敏感度可增加 4 倍, 但這對它們的使用不是必需的。

S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R O R e d 為受ZL保護的磺丙基氨基氨基苯乙烯基（ sulfopropylaminostyryl) 染料，在市面上可以買到，其規格為溶解于 D M S O 中 的 10 m m o l /L 儲備液。染色方法很簡單:① S D S - P A G E 后 ，將凝膠放在染色液里;②圖像采集之前, 用水簡單清洗凝膠。

制備染色液時, 在乙酸 [標準為 7 % ( V /V )，2 % ?1 0 % 都有同樣效果] 中將染料稀釋5 000 倍 至 2 umol/L 。染色液通常需要現配，但也能穩定保存數月。電泳之后將凝膠放在凝膠體積 10?2 0 倍 (一 塊 5 m L 的微型凝膠對應 50?100 m L ) 的染色液中，染色液放在聚丙烯或聚碳酸酯碟中并持續溫和地攪拌。將裝有凝膠的染色液碟置于紫外線燈箱或
藍光透照儀中可定期監控染色情況, 還可以通過手持式紫外線燈或藍光 L E D 監測染色情況 。通常對于 10 ug 的細胞裂解物，在熒光背景下 10 m i n 或 15 m i n 就可以看到大量蛋白質的熒光條帶。隨著染色過程進行，蛋白質條帶信號增加，而背景減弱、豐度較小的蛋白質的條帶也變得更明顯。對 于 I m m 厚的凝膠，染色可以在 I h 內完成，且凝膠在染色液
中放置數日都是穩定的。蛋白質-S D S -染料復合物在稀釋的乙酸中是穩定的, 但剩余的S D S 會從凝膠中擴散出來, 造成弱背景現象。因此應該最小限度地脫色。圖像采集之前 ，需要用水清洗凝膠以移除凝膠表面的剩余染料、S D S 和乙酸，清洗時水需要更換兩次 ，每次清洗需要 2?3 m i n 。

S Y P R O T a n g e r i n e 蛋白質凝膠染料為一種受ZL保護的昨哩基乙稀基（carbazolylvinyl) 染 料 ，根據推薦的染料稀釋液和預期用途，可 將 其 與 S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R OR e d 蛋白質凝膠染色劑區分開來。這種蛋白質染料可在中性 p H 緩沖液 (50 m m o l /L 鱗酸鹽、150 m m o l , ‘L N a C l ,p H 7. 0) 中使用，此時蛋白質條帶不會被固定，而且隨后可進行酶譜分析、洗脫、復 性 ，從而用于分析其離體活性或電轉印跡。商業渠道獲得的染料為10 m m o l /L 的 儲 備 液 ; 染 色 液 由 此 稀 釋 5000 倍 至 2 u m 〇 l/L , 現 用 現 配 。染色過程與S Y P R O O r a n g e 相 同 ，I h 內可完成; 圖像采集之前用水清洗凝膠。利用紫外線光源或藍光光源來完成光譜激發。

SYPRO R uby 蛋白質凝膠染色劑和其他基于釕的配方

諸 如 S Y P R O R u b y 蛋白質凝膠染色劑這樣的用于檢測凝膠中或印跡上的蛋白質的基于有機金屬釕離子的發光染色劑，可以用簡單的終點染色法步驟，提供與銀染法相媲美 ，甚至超越銀染法的熒光檢測敏感度，還 被 引 入 S D S ——P A G E 后 (Berggren et al. ,2000)或等電聚焦電泳后 (Steinberg et al.2000a) 的即用型染色液配方中。這些染料的發展與配方是以膠體考馬斯亮藍染色方案為基礎，其中的有機組分螯合發光的釕 (II) ，并且以同考馬斯亮藍染色法類似的方式為非共價蛋白質提供了基礎，即首先與堿性氨基酸發生離子作用，其 次 再 發 生 疏 水 作 用 。（4,7-二 苯 基 -1， 10-菲 繞 啉 酯）釕 [ruthenium II tris
(bathophenanthroline disulfonate)] 制備、染 色 方 案 及 與 S Y P R O R u b y 蛋白質凝膠染色法的比較的詳細說明告訴我們，S Y P R O R u b y 的染色原理與釕染色法很相似; 質譜分析反映出二者的一些微小差異，這些差異是由它們專有的化學性質引起的。隨 后 S Y P R O
R u b y 凝膠染色劑得到改進，最初配方的性能得到提升, 成為了一種適用于 S D S ——P A G E 和等電聚焦凝膠的即用型染色液 (Berggren et al, ,2002)。因 此 S Y P R O R u b y 與釕染色法的不同之處不僅在于突光化學方面，更重要的在于染色液配方方面, 即其擁有穩定的即用
型染色液和相對簡單的染色方案。

⑴ 用 5 0 % (V/V) 甲醇、1 0 % 0 VV ) 乙酸固定凝膠，固定時間為 30 min 至過夜。

(2) 凝 膠 用 S Y P R O R u b y 染 料 染 色 。這 是 一 種 終 點 染 色 法 ，染 色 3 h 至 過 夜 ，性質穩定。