熒光染色法結合了檢測靈敏度 (可與銀染法媲美) 與染色流程簡便性 (與考馬斯亮藍染 色 或 Z n 2+ 反染法相同），且其線性定量范圍較比色法大 10?100 倍 。檢測依賴于儀器,需要一個單色激發光源、能將波長較長的發射光從波長較短 (也更亮）的激發光中分離出來的選擇性光學濾鏡以及一個檢測模塊。對于許多熒光染料，可通過目視檢測，但是其靈
敏度不及采用攝像或儀器的方法。任何熒光染料都會帶來一定程度的光漂白, 這是曝光的結果。許多市面上可購買的熒光染料已得到改進，光穩定性相對較好。盡管如此，在目測和圖像采集前, 仍要小心避免將凝膠過久暴露于的外界強光之下。本章討論的熒光染色法和染料的激發與發射的極限值在表 31.1 中呈列。通 常 ，光激發和發射的顏色經常以大類區分，即紫外線（U V )250 ?400n m ; 藍 光 400?500 n m ; 綠 光 500?550 n m ; 黃光/橙 光 550?580 n m ; 紅 光 580?650 m n ; 近紅 外 線 650?850 n m 。這也是下面討論的目的。
熒光染料通常可分為兩類: 在蛋白質條帶部位表現出顯著加強熒光效果的熒光染料和特異地結合蛋白質條帶而不與凝膠基質結合的自發熒光染料。最早商品化的總蛋白質熒光染料，S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R O R e d 凝 膠 染 料 于 1 9 世 紀 9 0 年代出現。這些染料最初是用于凝膠中染色 D N A 的常規熒光檢測, 其檢測方法是，先 經 300 n m 紫外線透射，隨后進行寶利來一步攝影 (Polaroid photography)。開發上述商品化突光染料的目的是建立類似于溴化乙淀或 S Y B R Gre e n D N A 染色法一種簡單的、一步式的總蛋白質特異染色和記錄的工作流程，并且具有超越考馬斯亮藍染色方法的檢測靈敏度。總蛋白質染料進一步的發展，產生了一些檢測靈敏度范圍近似于甚至超越了銀染法的商業產品或配方。那些不需要在電泳前為樣品加上共價標簽的熒光凝膠染色法，與之后洗脫蛋白質條帶的質譜分析相兼容。
尼羅紅蛋白質凝膠染色劑
尼羅紅 (Nile red) 是一種吩囉嗪酮類染料, 當其從水轉入到疏水環境，如 S D S 微粒或蛋白質-S D S 復合物中時，便顯示出強烈的熒光增強作用。尼 羅 紅 不 會 與 S D S 單體發生顯著作用》利用這一特點開發出了一種適合 S D S 凝膠的迅速的不用固定的總蛋白質染色法。該方案要求電泳在非標準條件下進行，即電泳緩沖液 S D S 含 量 為 0. 0 5 % (m /V )，要 低 于 去 污 劑 的 臨 界 膠 束 濃 度 ，而 不 是 通 常 應 用 于 一 維 和 二 維 S D S -P A G E 的 0. 1 %(m/v ) 的 S D S 含量。蛋白質樣品制備要符合規格 (Garn n ,1990a ;1990b )，如 此 S D S -蛋白質復合物在電泳時才會保持穩定, 蛋白質條帶的遷移也被認為是正常的。這種方法簡單快速: 將尼羅紅儲備液 (0.4 m g /m L 保 存 在 D M S O 中）在 水 中 稀 釋 200 倍 ，至終濃度為2 ug/m L , 每塊凝膠加人超過 1 0 倍膠體積的染液 (如 一 塊 5 m L 的微型凝膠需要 50 m L染色液) 并立即充分攪動。染料在水中會快速地沉淀，故最理想的染色應該為 2?5 m i n ，超過這個時間效果也不會增強。染色之后, 用水簡單地清洗凝膠。可用紫外線或綠光光源激發, 蛋白質條帶會出現淡紅色。本法檢測靈敏度與考馬斯亮藍染色法相似。因為沒有 固 定 ，尼 羅 紅 染 色 的 凝 膠 在 隨 后 電 泳 印 跡 轉 移 時 有 較 好 的 轉 移 效 率（ D a b a n ，2001;D a b a n et al.,1991)。染料的沉淀會在凝膠介質中形成高熒光背景，并 且 染 料 對 S D S 膠團的親和性加上染料的不溶性使得該方法不能用于電泳緩沖液中含 0?1 % S D S 的 S D S ^P A G E 。染料的光穩定性也存在問題。
S Y P R O O r a n g e、S Y P R 〇 R e d 和 S Y P R O
Tangerine 蛋白質凝膠染色劑
S Y P R O R e d 和 S Y P R O O r a n g e 蛋白質凝膠染色劑是由 Steinberg 等 (1996a ;1996b )和 H a u g l a n d 等 (I” 7) 描述 的 ，S Y P R O T a n g e r m e 蛋 白 質 凝 膠 染 色 劑 是 由 Steinberg 等(2000b ) 和 Y u e 等 (2003) 描述的，所有這三種染色劑也同樣經 Steinberg 等（2005) 討論過 。這些染色劑含有一個親水官能團、一個芳香族的熒光團及一個脂肪族尾部，使染料既具有良好的水溶性，又具有很強的插人蛋白質-S D S 復合物、S D S 微粒或膜的能力, 非極性環境下還有強烈的熒光增強作用。這些特征，再加上良好的化學和光學穩定性，可使染料以簡便多樣的染色步驟通用于標準緩沖液條件 (〇. 1 % S D S )S D S ——P A G E 后的染色，其檢測敏感度超越了膠體考馬斯亮藍 0 2 5 0 染料。非標準緩沖液條件下 (0.05% S D S ) ，這些
染料與尼羅紅相比染色敏感度可增加 4 倍, 但這對它們的使用不是必需的。
S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R O R e d 為受ZL保護的磺丙基氨基氨基苯乙烯基（ sulfopropylaminostyryl) 染料，在市面上可以買到，其規格為溶解于 D M S O 中 的 10 m m o l /L 儲備液。染色方法很簡單:① S D S - P A G E 后 ，將凝膠放在染色液里;②圖像采集之前, 用水簡單清洗凝膠。
制備染色液時, 在乙酸 [標準為 7 % ( V /V )，2 % ?1 0 % 都有同樣效果] 中將染料稀釋5 000 倍 至 2 umol/L 。染色液通常需要現配，但也能穩定保存數月。電泳之后將凝膠放在凝膠體積 10?2 0 倍 (一 塊 5 m L 的微型凝膠對應 50?100 m L ) 的染色液中，染色液放在聚丙烯或聚碳酸酯碟中并持續溫和地攪拌。將裝有凝膠的染色液碟置于紫外線燈箱或
藍光透照儀中可定期監控染色情況, 還可以通過手持式紫外線燈或藍光 L E D 監測染色情況 。通常對于 10 ug 的細胞裂解物，在熒光背景下 10 m i n 或 15 m i n 就可以看到大量蛋白質的熒光條帶。隨著染色過程進行，蛋白質條帶信號增加，而背景減弱、豐度較小的蛋白質的條帶也變得更明顯。對 于 I m m 厚的凝膠，染色可以在 I h 內完成，且凝膠在染色液
中放置數日都是穩定的。蛋白質-S D S -染料復合物在稀釋的乙酸中是穩定的, 但剩余的S D S 會從凝膠中擴散出來, 造成弱背景現象。因此應該最小限度地脫色。圖像采集之前 ，需要用水清洗凝膠以移除凝膠表面的剩余染料、S D S 和乙酸，清洗時水需要更換兩次 ，每次清洗需要 2?3 m i n 。
S Y P R O T a n g e r i n e 蛋白質凝膠染料為一種受ZL保護的昨哩基乙稀基（carbazolylvinyl) 染 料 ，根據推薦的染料稀釋液和預期用途，可 將 其 與 S Y P R O O r a n g e 和 S Y P R OR e d 蛋白質凝膠染色劑區分開來。這種蛋白質染料可在中性 p H 緩沖液 (50 m m o l /L 鱗酸鹽、150 m m o l , ‘L N a C l ,p H 7. 0) 中使用，此時蛋白質條帶不會被固定，而且隨后可進行酶譜分析、洗脫、復 性 ，從而用于分析其離體活性或電轉印跡。商業渠道獲得的染料為10 m m o l /L 的 儲 備 液 ; 染 色 液 由 此 稀 釋 5000 倍 至 2 u m 〇 l/L , 現 用 現 配 。染色過程與S Y P R O O r a n g e 相 同 ，I h 內可完成; 圖像采集之前用水清洗凝膠。利用紫外線光源或藍光光源來完成光譜激發。
SYPRO R uby 蛋白質凝膠染色劑和其他基于釕的配方
諸 如 S Y P R O R u b y 蛋白質凝膠染色劑這樣的用于檢測凝膠中或印跡上的蛋白質的基于有機金屬釕離子的發光染色劑，可以用簡單的終點染色法步驟，提供與銀染法相媲美 ，甚至超越銀染法的熒光檢測敏感度，還 被 引 入 S D S ——P A G E 后 (Berggren et al. ,2000)或等電聚焦電泳后 (Steinberg et al.2000a) 的即用型染色液配方中。這些染料的發展與配方是以膠體考馬斯亮藍染色方案為基礎，其中的有機組分螯合發光的釕 (II) ，并且以同考馬斯亮藍染色法類似的方式為非共價蛋白質提供了基礎，即首先與堿性氨基酸發生離子作用，其 次 再 發 生 疏 水 作 用 。（4,7-二 苯 基 -1， 10-菲 繞 啉 酯）釕 [ruthenium II tris
(bathophenanthroline disulfonate)] 制備、染 色 方 案 及 與 S Y P R O R u b y 蛋白質凝膠染色法的比較的詳細說明告訴我們，S Y P R O R u b y 的染色原理與釕染色法很相似; 質譜分析反映出二者的一些微小差異，這些差異是由它們專有的化學性質引起的。隨 后 S Y P R O
R u b y 凝膠染色劑得到改進，最初配方的性能得到提升, 成為了一種適用于 S D S ——P A G E 和等電聚焦凝膠的即用型染色液 (Berggren et al, ,2002)。因 此 S Y P R O R u b y 與釕染色法的不同之處不僅在于突光化學方面，更重要的在于染色液配方方面, 即其擁有穩定的即用
型染色液和相對簡單的染色方案。
⑴ 用 5 0 % (V/V) 甲醇、1 0 % 0 VV ) 乙酸固定凝膠，固定時間為 30 min 至過夜。
(2) 凝 膠 用 S Y P R O R u b y 染 料 染 色 。這 是 一 種 終 點 染 色 法 ，染 色 3 h 至 過 夜 ，性質穩定。
(3) 用 10% 〇 //V ) 甲醇、7 % ( V /V ) 乙酸進行簡單的凝膠脫色。
利用基于微波爐的方案可以加快染色過程的進行。 SYPRO R uby 蛋白質凝膠染料具有相對較高的消光系數和量子產率，因此它十分亮眼, 化學穩定性和光穩定性都很高。光譜的激發可借助紫外線或是藍光光源; 蛋白質帶目測呈橘紅色。熒光蛋白質染色的機制在于該染料與蛋白質條帶和凝膠介質結合的差異性, 凝膠介質不與染料結合。因此蛋白染色劑本身是不具熒光性的。 SYPRO R uby 蛋白質凝膠染料亮度大、穩定性高、檢測靈敏度強且便于使用，加上其蛋白質組應用的文獻之多以及積極的市場營銷攻勢，該產品
為其后蛋白質凝膠染色劑的發展提供了比較標準，正如銀染法仍然是檢測靈敏度的比較基準一樣。
Epicocconone 蛋 白 質 凝 膠 染 色 劑 ： Deep Purple 和 Lighting Fast 蛋白質凝膠染色劑
Epicocconone 蛋 白 質 凝 膠 染 色 劑 是 種 從 真 菌 黑 附 球 菌 (EpicoccMOT Tiignwn) 中提取的熒光團，用于總蛋白質染色試劑盒中。該染料被冠以了多種商品名稱，包 括 DeepPurple 和 Lighting Fast 總蛋白質凝膠染料，方案各異。下面是一種方案。
(1) 將 SDS-PAGE凝 膠 在 7.5%(V/V) 的 乙 酸 中 固 定 1h。
(2) 用水清洗凝膠 (2X 30 m i n )。
(3) 熒光團儲備液在水溶液中稀釋后, 將凝膠在該水溶液中染色 I h。
⑷ 將 凝 膠 在 0. 05% (V /V ) 的氨水中孵育 (3X 10 m i n );
(5) 立即捕捉影像，可用紫外線、可見藍光或可見綠光激發。
該染色劑的靈敏度可與 S Y P R O R u b y 蛋白質凝膠染料相媲美，或 者 較 之 更 好（Belland K a r u s o ，2003; Mackintosh etal. ，20 〇 3)。染色是可逆的，并與質譜分析兼容。暗紅色的信號并非特別顯著，其靈敏度完全取決于染色劑的熒光特性, 因此背景較弱。該染色方法似乎需要痕量的在乙酸固定后仍然與蛋白質形成復合物的 S D S 。 這種染色劑在水中僅發出微弱的熒光 (綠色），但 是 在 經 S D S 處理的蛋白質存在的情況下，熒光增強并發生紅移 。 Epicocconone 蛋白質凝膠染料已被證實能與賴氨酸反應，形成可被堿水解的熒光加合 物 ，因此產生突光并使得染色具有可逆性 (Coghlan et al. ,2005)。濃縮的染色儲備液必須冷凍保存，在使用前解凍。考慮到穩定性因素，影像捕捉應該在染色結束后立即進行。
熒光素衍生物
含有烴類尾部的熒光素衍生物是很有效的蛋白質凝膠染色劑。將 5-十二酰基氨基-(C 12-F L )、5-十六酰基氨基-(C 16-F L ) 及 5-十八酰基氨基-奕光素-(C 18-F L ) 用于一些類同于經典考馬斯亮藍 R -250 染色法的樣品染色方案中，可證明該染色劑敏感度比得上銀染法。最 有 效 的 熒 光 團 為 C 16-F L 。例 如 ，凝 膠 染 色 時 染 液 為 3 0 % (V /V ) 乙醇、7. 5 %(v/v) 乙 酸 、1umol/L 染料, 染液更換兩次。再用水清洗，水也要更換兩次，最 后 用 7.5%乙酸脫色。染色劑具焚光性，易知其基本原理是同結合在復合蛋白質中的殘余 S D S 相結合; 可兼容質譜分析 ( K a n g et a L ，2003)。熒光素的光譜激發和發射分別由藍光和綠光完成。
K r y p t o n 蛋白質凝膠染色劑
K r y p t o n 蛋白質凝膠染色劑是受ZL保護的輕基喹啉 (hydroxyquinoline) 類染料配方 ，激發光譜為綠色，突光顯色為橙色 (Wolf et al. ,2007) 。 K r y p t o n Infrared 蛋白質凝膠
染色劑含受ZL保護的香豆素/氟喹諾酮和/或瑪蒂娜 (Martina) 型染 料 , 激發光譜為紅光/近紅外線，發射光譜為近紅外線 ( C z e m e y et al. ,2008)。可以買到這些產品的 10X 的組分 并 需 要 先 稀 釋 成 可 用 的 溶 液 。這 些 產 品 在 檢 測 靈 敏 度 和 動 態 線 性 范 圍 方 面 同S Y P R O R u b y 和 D e 印 P u r p l e 蛋白質凝膠染色劑相當。染色方案依照標準的固定-染色-快速脫色的工作流程，并在快速染色方面得到改進, 因此整個染色過程可在 1?4 h 完成；若要追求最高靈敏度和信號線性度, 可以延長此方案的時間。這些染色劑均可以和質譜分析兼容使用。
F l a m i n g o 蛋白質凝膠染色劑
Flamingo 蛋 白 質 凝膠染色劑是受ZL保護的基于香豆素的花青染料配方（Berkelm a n ，2006)。該染色方案需要在染色前完成固定。可以買到的染料為 I O X 的儲備液，使用前用水稀釋即可。當染料與蛋白質結合時表現出熒光增強作用。該染色劑背景較弱，報道稱短脫色步驟可使背景進一步減弱。激發光譜在綠光范圍內, 信號為橙色/紅色。該染色劑被認為與銀染和 S Y P R O R u b y 相當，并且也可以兼容質譜分析。
L U C Y 蛋白質凝膠染色劑
LUCY蛋白質凝膠染色劑是受ZL保護的三甲川花青(trimethinecyanine) 染料配方 , 在 S D S /蛋白質混合物中表現出熒光增強作用。染色通常在稀釋的乙酸中進行，方法與 S Y P R O O r a n g e —樣 。據報道該染色劑也能與質譜分析兼容 (Kovalska et al.,2006)。
琥珀醜亞胺酯是一種用于電泳前蛋白質樣品的共價氨基標記的電荷平衡的花青染料(Cydye)，它的研發和使用已成為熒光二維差異凝膠電泳（2- D D I G E ,—種非常重要的蛋白質組技術）的基礎（M i n d e n et al. ,2002; T o n g e et al. ,2001; W a g g o n e r et aL ,1993)。D I G E 在 第 30 章中有更詳細的討論。有許多熒光復合物的琥珀酰亞胺酯以及其他能反應的熒光共價蛋白質標記物也同樣被廣泛使用（H a u g l and ，2005)s 如今擁有了廣泛的儀器基礎，對任何熒光標記的蛋白質制備物組分進行凝膠分析已是常規步驟。
作為基本的細胞信號機制, 指定氨基酸殘基的可逆磷酸化作用的重要性已無需爭辯。當前磷蛋白染料具有受ZL保護的構型，即磷酸基結合部分共價連接于熒光團。檢測的方式是選擇性結合磷酸化的氨基酸，但是沒有熒光增強作用。從某種程度上講, 許多可溶的熒光復合物都可作為總蛋白質染色劑。一種選擇性磷蛋白染料需要含有一個磷酸基結合部分、一個對總蛋白質的自發突光很低的熒光團 、 一 種可抑制非特異性總蛋白質染色的組分及一個促進殘余的非特異染色解離的脫色方案。每個多肽中與總蛋白質染色劑靶定
的氨基酸數量相比，靶定的磷酸基僅有少數。磷蛋白檢測敏感性通常和用膠體考馬斯染色 劑 或 SYPRO O range 染 色 劑進行總蛋白質檢測時處于同一水平，而不及銀染劑或SYPRO Ruby 染色劑那么敏感。凝膠中蛋白質磷酸化檢測需要有適當的對照，包括展示已知的磷酸化狀態（陽性對照) 或去磷酸化狀態（陰性對照）的蛋白質, 并且如果可以的話，還需有用活性憐酸酶對樣品進行處理的對照。在檢測到磷蛋白信號后，需要用一種總蛋白質染色劑對凝膠進行染色。市面上可以買到的磷蛋白染色劑可與隨后的考馬斯亮藍染色劑、銀染劑或總熒光染色劑 (如 SYPRO Ruby) 兼容, 但不能與依賴 SDS 的熒光染色劑(如 SYPRO Orange) 兼容。磷蛋白染料可與隨后的分析步驟，如質譜分析或肽測序相兼容。
Pro-Q D i a m o n d 磷蛋白凝膠染色劑（Life Technologies) 系一種即用型配方，是根據磷酸肽 (p h o s p h o p 印 tide) 固定金屬親和層析的原理發明的，利用的是溶液中熒光團連接的金屬螯合部分，這種溶液含金屬離子、鹽和可與水混溶的有機溶劑，用緩沖 液 調 p H 至4(A g n e W e tal.，2006)。這種染色方案需要在甲醇/乙酸溶液中固定，用水清洗以去除固定劑 ，用 P r o - Q D i a m o n d 配方進行染色，隨后在含 1,2-丙二醇混合物中脫色，在乙腈中脫色效率更高 [如 50 m m o l /L 乙酸鈉 (P H 4)、1 5 % ?2 0 % 1,2-丙 二 醇 或 1 5 % ?2 0 % 乙腈]。微型凝膠中的磷蛋白檢測需至少 1?2 n g 的丨酪蛋白（一種五磷酸化蛋白質) 或 8 n g 胃蛋白酶 (一種單憐酸化蛋白質），該檢測法具有 1000 倍的線性動態檢測范圍。總蛋白質染色后，再 使 用 P r o - Q D i a m o n d 染色劑可得知蛋白質的體外磷酸化狀態或去磷酸化狀態。
可以買到 P h o s -t a g 磷蛋白染色劑 (Perkin E l m e r) 的試劑盒包裝, 其采用與 P r o - Q Dia m o n d 染色劑相同的通用染色策略，卻有與之不同的緩沖液組分。 這些染色劑含有已有充分描述的 P h o s-t a g 結合部分，g 卩醇鹽-橋的雙核鋅 (II) 配合物。該分子是根據可逆的磷酸鋅 (II) 配合物的酶學原理設計的。解離常量為 25 n m o l /L 的 P h o s-t a g 苯基磷酸鹽復合物與其他磷酸基結合部分的微摩爾解離常量的對比已有描述（Kinoshita et al. ,2004;K o i k e e t a L ，2007)。在某些情況下,Ph o s-t a g 技術對基于凝膠的磷蛋白分析比直接膠內憐蛋白染色更有效 (Kinoshita et al. ，2006; Y a m a d a et al. ，2007)。可買到的 Phos-tag 凝膠 染 色 劑 試 劑 盒 ，可 以 選 擇 雙 熒 光 ，最 大 激 發 光 譜 為 ： P h o s-t a g 磷 蛋 白 凝 膠 染 色 劑300 n m /460 n m (雙激發最大值) 或 540 n m 。近期報道稱，使 用 Phos-tag 300/460 染色劑來檢測一種具細菌性應答調節子的天冬氨酸磷酸化 (BarHeri and Stock，2008)。