蛋白質凝膠電泳凝膠的制備

丙烯酰胺

去離子水 SDS 濃鹽酸 Tris 過硫酸胺 TEMED 甘氨酸

電泳槽 電泳儀 加樣器 吸頭

1.  根據垂直電泳槽說明書安裝玻璃板，確定需配制分離膠的濃度和體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液”所列成分（見書末附錄）配制所需分離膠；

2.     迅速將分離膠注入兩玻璃板間隙中，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長再加1cm，用滴管小心地在分離膠上覆蓋一層0.1% SDS（當丙烯酰胺濃度≤8%時）或異丁醇或水（當丙烯酰胺濃度≥10%時），覆蓋層可防止氧擴散進入凝膠而抑制聚合反應。將凝膠垂直置于室溫下；

3.    分離膠聚合完全后，倒出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數次以除去未聚合的丙烯酰胺，盡可能排除凝膠上的液體；

4.    確定需配制濃縮膠的體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液”（見書末附錄）配制所需濃縮膠，然后直接將濃縮膠灌注在分離膠上，立即插入干凈的配套梳子，避免氣泡，然后加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙。待濃縮膠聚合后，拔出梳子，形成加樣孔；

5.    用去離子水將Tris-甘氨酸電泳緩沖液貯存液稀釋5倍，倒入電泳槽，將加樣孔充滿，這時加樣孔中的氣泡可通過電泳緩沖液排除。

1. 由于與凝膠聚合有關的硅橡膠稱、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；剝膠時凝膠板易斷裂，為防止引現象，所用器材均應嚴格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”仔細清洗。玻璃板浸泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。

2. 安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽板梳齒應平整光滑。

3. 在不連續電泳體系中，預電泳只能在分離膠鄉合后進行。洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。

4. 電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或過低無可影響電泳效果。

5. SDS純度：在SDS-PAGE中，需高純度的SDS,市售化學純SDS需重結晶一次或兩次方可使用。重結晶方法如下：稱20g SDS放在圓底燒瓶中，加300ml無水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸，回流約10min,用熱布氏漏斗趁熱過濾。濾液應透明，冷卻至室溫后，移至-20℃冰箱中過夜。次日用預冷的布氏漏斗抽濾，再用少量-20℃預冷的無水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS處理蛋白質樣品時，每次都會在沸水溶中保溫3——5min,以免有亞穩聚合物存在。

7. 標準蛋白質的相對遷移率最好在0.2——0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測定未知物分子量時，都應同時用標準蛋白制備標準曲線，而不是利用過去的標準曲線。用此法測定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測得精確的分子量范圍，最好用其他測定蛋白分子量的方法加以校正。此法對球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測定較好，對糖蛋白，膠原蛋白等分子量測定差異較大。

8. 對樣品的要求：應采納低離子強度的樣品。如樣品中離子強度高，則應透析或經離子交換除鹽。加樣時，應保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10-15μl為宜，如樣品系較稀的液體狀，為保證區帶清晰，加樣量可增加，同時應將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。

9. 由于凝膠中含SDS,直接制備干板會產生龜裂現象。如需制干板，則用25%異丙醇內含7%乙酸浸泡，并經常換液，直到SDS脫盡（約需2-3天），才可制備干板。為方便起見，常采用照像法，保存照片。

不連續聚丙酰胺凝膠電泳包含兩種不同緩沖液成分、ph值和凝膠孔徑，而且在電泳過程中形成的電位梯度均不同，由此產生了濃縮效應、電荷效應和分子篩效應：

（1）濃縮效應：樣品在開始電泳時，通過濃縮膠濃縮成高濃度的樣品薄層；

（2）電荷效應：在均一電勢梯度和PH的分離膠中，由于各蛋白質的等電點不同所帶電荷量不同，在電場中所受到的引力不同，經過一段時間的電泳，各種蛋白質就以一定順序排列成一條條蛋白質區帶；

（3）有分離膠孔徑較小，分子量大小和分子形狀不同的蛋白質通過分離膠后，所受的阻滯程度不同，因而遷移率不同而被分離。