蛋白質分離純化是用生物工程下游技術從混合物之當中分離純化出所需要得目的蛋白質的方法。應用于（1） 化學物質的分離、提純、濃縮;（2）染料、染料中間體的濃縮及脫鹽（3）超細粉體生產過程中的產品回收;（4）生產廢水中有用物質的提純、回用;（5）海洋生物提取物的濃縮、提純（6）氨基酸、蛋白質的濃縮、提純。
| 實驗方法原理 | 凡鹽析所獲得的粗制蛋白質（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。 |
|---|
| 實驗材料 | Sephadex G-25葡聚糖凝膠G-25 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | 磷酸鹽緩沖液碘化鉀碘汞蒸餾水磺基水楊酸溶液 |
|---|
| 儀器、耗材 | 錐形瓶量筒層析柱比色磁盤試管皮頭滴管 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、試劑與器材
1. Sephadex G-25。
2. 0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
3. 奈氏（Nessler）試劑：于500 ml錐形瓶內加入碘化鉀150 g，碘110 g，汞150 g及蒸餾水100 ml。用力振蕩7～15 min，至碘的棕色開始轉變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內繼續振蕩，直到棕色的碘轉變為帶綠色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000 ml量筒內，加蒸餾水至2000 ml，混勻備用。
4. 20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
5. 1.5cmx20 cm層析柱。
6. 黑、白比色磁盤。
二、操作
1. 取層析柱1支（1.5 cmx20 cm），垂直固定在支架上，關閉下端出口。將已經溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17 cm左右，關閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。
2. 凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內。凝膠柱面上加一層的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5 ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
3. 在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。
4. 由經檢查含有蛋白質的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為"脫鹽”后的IgG。
注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。 展開 |
|---|
| 注意事項 | 在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。 |
|---|
