二、一向電泳（13cm的holder）
（1）取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達到250vl
（2）將上述溶液加到holder 的兩個電極之間。
（3）去掉膠條的保護膜，膠面朝下，先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡，最后放下膠條平端，使溶液浸濕整個膠條。
（4）在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。
（5）將膠條槽平放于一向儀器上，與水平方向垂直。
（6）設置儀器的運行參數：
三、膠條的平衡（由一向到二向）
（1）將膠條放入10ml 平衡緩沖液中（加入10mgDTT）封口，在振蕩儀上振蕩15 分鐘。
（2）將膠條取出放入10ml 新的平衡緩沖液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振蕩儀上振蕩15 分鐘。
（3）用去離子水潤洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘，以去除多余的平衡緩沖液。
四、二向電泳
（1）將平衡好的膠條直接轉移到第二向制好的SDS膠上，然后用瓊脂糖封頂，準備第二向電泳.
（2）設置儀器的運行參數：
五、平板膠的染色
硝酸銀染色：（整個操作在搖床上進行）
（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去離子水，60 分鐘。
（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），17g醋酸鈉，165ml去離子水，30分鐘。
（3）清洗：用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘。
（4）銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）20 分鐘。
（5）顯色：6.25g碳酸鈉，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去離子水。
（6）終止：5%的醋酸。
（7）照相分析。
（8）保存制作干膠。
藥品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。
平衡緩沖液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87%的甘油69ml，SDS
4g，溴酚藍少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍少許溶于無菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液
0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
制作平板膠：
分離膠的配制方法：
藥品/濃度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%
丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
分離膠緩沖液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
無菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
10%過硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
*在灌膠之前加入
藥品配制：
丙烯酰胺單體儲液：丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml分離膠緩沖液：Trisbase181.5g 溶于750ml
無菌水中調pH8.8總體積1000ml10%SDS：SDS5g溶于無菌水中總體積50ml10%的過硫酸胺：0.1g溶于無菌水中總體積1mlSDS
電泳緩沖液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于無菌水中總體積5000ml
封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml 瓊脂糖0.5g溴酚藍少許附：蛋白質含量測定的方法（Bradford 方法）
原理：這一方法基于2 考馬斯亮藍G－250
有紅藍兩種不同的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白質結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩定。反應化合物在
465－595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關系，因此可檢測595nm的光吸收值的
大小計算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford儲存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG藍
室溫下長期保持穩定。
2）Bradford工作液
425ml雙蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford儲存液
用濾紙過濾，保存于室溫棕色瓶中，可保存數周，但在使用前需要過濾。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做標準曲線：取樣品即可測量。
注意事項：
1、樣品的問題：
樣品制備是做好2-d
的關鍵，這句話好象有點多余，如果樣品中離子濃度過大，根本做不了2d，我開始的時候由于提取方法有問題，結果浪費了很多時間和IPG膠條，真的很心痛呀！另外再說明一點，最好用新鮮的樣品提取蛋白質，蛋白點的差異很大，新鮮的樣品點多，而我用存放在-80
的樣品跑出來效果差了很多呀！如果你不確定你的蛋白提的如何，建議你先跑sds-page。檢驗一下。關于蛋白的提取方法，我還想聽聽各位的建議。
2、上樣量的問題，我覺得我跑的這張2D 圖，上樣量還需要調整，可以適當降低，我的ipg 膠條是13 厘米的上樣量在50ng-80ng之間，上樣量不合適，豐度低的將會被豐度高的所遮蓋，這是最討厭的問題。
3、跑一向的時候大家都差不多，根據公司的說明就可以做了。跑二向的時候我現在一般做恒壓，以前做過恒流，沒感覺有什么差異，還想請教各位！橫流和恒壓到底哪個更好一些！
4、ipg 膠條ph 的選擇，我做的是植物的花藥，一般情況下酸性端點多一點，堿性端較少，我現在選用的是ph3-10
的，我覺得很不合適，（不過這個膠條是免費的）因此好多點沒能很好的分開，如果膠條的ph小一點，膠條（我希望能達到18cm）可是我們這里做不了，效果應該比這個好很多的！
5、從這塊膠上，我覺得致命點就是背景深，將影響我下一步的分析。所以銀染還需要改進！
6、針對不同的蛋白質，分離膠的濃度也是可以調節的，我比較懶，就作過10%，12.5%的，不過覺得都不適合.