反相高效液相色譜和質譜（MS）的聯用為蛋白質/多肽分析提供了強大的工具。
20世紀80年代，約翰·貝內特·芬恩和他的同事們開發了電噴霧離子源，使質譜與反相高效液相色譜得以聯用。
采用液相色譜-質譜聯用的好處包括：
質譜是非常靈敏的檢測技術。
質譜可以提供所分離多肽/蛋白質的分子量。
質譜可利用分子量特異性檢測蛋白質。
片段信息有助于確認多肽。
質譜基于電荷和質量進行分離和測定，因此，與基于疏水性分離的反相色譜“正交”。
高效液相色譜-質譜聯用廣泛用于肽圖的分析，提供了一種正交檢測肽法（參考文獻15）。
如圖26所示，總離子質量色譜圖與紫外色譜圖相似，但由于正交檢測的使用，峰的大小不同。
事實上，采用紫外檢測出現的小峰在質譜圖中會更明顯（見圖26“*”）。
圖26. 肽圖的分離可以通過紫外檢測和質譜檢測來監測。
峰高是檢測法的一個函數，在紫外圖譜和質譜圖譜間有明顯不同。
特別是用“*”標示的肽對。它們在UV檢測圖譜中顯示的峰值較小，但在質譜圖中峰值較大。
通過測定每個峰中肽的分子量，質譜分析法為識別RP-HPLC法分離的峰提供了有用的信息。
由于質譜與反相高效液相色譜正交，因此質譜還能確定峰純度或顯示兩種或兩種以上肽的共洗脫，并能提供肽的分子量。
圖27以肽圖中的三個峰值展示了這一點。A峰較早洗脫出來，是分子量為439道爾頓的四肽。B峰是一種糖肽，有寡糖或多聚糖吸附。
通過質譜圖中B峰存在質荷比為204和366兩種離子確定，這表明存在糖基化反應。
C峰是一種二硫化物連接的二肽——由二硫鍵連接的兩個多肽。
顯示該肽有四種離子形式：+1、+2、+3和+4。只有含兩個氨基末端和兩個堿性氨基酸的二肽才會出現+4離子。
圖27. 反相色譜強大的分離能力與第二個維度的質譜的結合為肽圖提供了大量的信息。
A. MS確認A峰代表小分子肽。
B. 檢測到的B峰代表含多聚糖（糖）的肽。
C. C峰代表一種二肽——由二硫鍵連接的兩個肽。
