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此節主要分為兩個子節。在 3.1
節中，我們提出與庫的設計與表征相關的問題。在 3.2 節中，我們分析評價庫的質量或者庫的篩選結果的顯著性。在前兩節中，我
們給出了公式以及提供了數值范例，用示例來加以說明而沒有給出詳細的理論解釋。完整的理論說明可以在注釋（見 8.4 節）中找到。
3.1 庫表征
我們設計一個包含 n 個可能的不同的理論變量庫。我們從這個理論庫中隨機取樣 m 次；形成一個 m 個變量的樣本集。我們提出如下問題。
A. 在選擇的 m 個變量中我們期待多少個理論變量（全部為 n 個）不會出現？
B. 在選擇的 m 個變量中至少一個理論變量（全部為 n 個）沒有被取樣的概率是多少？最多一定量的理論變量（全部為 n 個）沒有被取樣的概率是多少？
C. 我們期待一個特定變量 i 多少次出現在樣本中？更通俗地說，i 出現 r 次的概率是多少？
這些問題作為一組提出，是因為如 3.1.1 節和 3.1.2 節中所述，上述問題的解決是基于同樣的理論。我們用尺表示當我們隨機地從理論庫中取樣一次變量 i 出現任意次的概率。
我們分成兩種不同情形，在下面的小節中不同處理：
( 1 ) 在 3.1.1 節中，等概率結果，即 n 個變量被取樣的概率是相同的。這里 Pi =1/n，這個例子被作為一般化處理。
( 2 ) 在 3.1.2 節中，這里結果的出現是非等概率型的，即一些變量比其他一些有更好的概率被取樣。根據定義，很難把這種情形進行一般化處理，因為對于上述問 題 A、B 和 C，答案取決于概率本身。作為示例，我們詳細處理一種非等概率的情形。
如果一個給定序列出現的頻率或者我們感興趣的被編碼的特性都沒有任何偏差，則稱為等概率情形。在這種情形的庫選擇中，如果我們感興趣的性質是獨立于其他參數的，或者對其他參數的影響可以忽略，我們考慮其為等概率的。如果考慮密碼子具有偏好性或簡并性，或者結果會影響到整個系統，則為非等概率情形。一個結果影響
整個系統的例子如下：當在體內篩選酶 X
的高催化活性時，增加的產物會對整個系統有毒性，產生對檢測酶催化活性的不良反應。這樣的參數一般來說過去復雜而不用系統地說明。然而我們可以考慮利用偏好性密碼子，其中氨基酸的出現是非等概率事件，其他參數盡管也是非等概率的，但是可以被量化。
3.1.1 等概率情形
這是最簡單的情形，其中所有結果都可以被考慮成等概率事件：對庫中的成員進行取樣后，所有 n 個變量都有同樣的機會被選中，即 Pi =1/n。
注意，缺失變量數目的期望值不必是整數；這里缺失變量數目的期望值為 45~46 個（整體理論變量數目為 1 X 106 個)。
如果我們從 n = 1 X 106 個理論變量庫中取樣 m = 2 X 107 次，則 λ = 0.00206。這樣，缺失變量的期望值為 0 或 1 個，且更加接近于 0。事實上，在這個例子中，0 或 1 個變量缺失的概率是僅有的非小概率事件，0 缺失更加可能（> 99%，見 3.1.1 問題 B 中的計算）。
我們可以得出結論：取樣大小為理論庫的 20 倍時（m = 20 n)，可以導致原則上對理論庫的完全取樣，如圖 8.5 所示。取樣 10 倍過量可以導致一小部分組分沒有被取樣 ( 當理論庫中少于 104 個變量時，此組分趨向于 0，見表 8.2 )；對于很多的實驗目的來說，知道還有一小部分沒有被取樣已經達到要求。
請注意表 8.2 給出一些違反直覺的結果：如果取樣大小 m 等于庫的大小 n，我們可以期待平均大概 37% 的理論變量將不被取樣；甚至當 m=2n 時，理論變量不被取樣的平均概率是 13.5%，遠小于應該被完全取樣的結果。
對于我們的主要例子（n= 1 X 106；m= 2 X 107) ，從 n 個理論變量中選取的 m 次中少于 50 個沒有被取樣的概率可以由加和每一個 0，1，2，…，直到 49 個沒有被取樣的概率計算得出，大約是 78%，即
與此類似，少于 60 個沒有被取樣的概率大約是 98%。為了簡化計算，可以利用 Excel 計算單（見 8.2 節及圖 8.1)。
即小于 1% 的機會。某個變量出現 3 次的結果會提示系統中有偏差嗎（如由于選擇壓力造成的）？關于這個問題的討論見 8.3.2 節。
最后，某變量出現 10 次或以下的概率可以由相加出現 10 次，9 次等的概率直到出現 0 次的概率算出，可以手算也可以利用 Excel 工作單（見 8.2 及圖 8.1)。我們看到在這個例子中出現 10 次或更少的概率大約是 58.3%。
3.1.2 非等同概率的一個例子
我們給出出現非等同概率事件的一個例子，即 n 個變量中的一些變量會比平均情況更多或更少的機會出現。如 3.1 節開頭所述，很難得出非等同概率事件的普遍規律，因為答案取決于具體概率是什么。我們這里提供的例子中給出一些簡明的計算，同時也提示了可能遇到的困難。
在沒有選擇壓力時，非等同概率事件可以在有偏好的
DNA 庫中出現，這種庫偏好性可以是設計的也可以是意外產生的。例如，在寡核苷酸引物合成過程中出現的意外偏差。這樣的偏差可以在隨機取樣 DNA
庫測序后發現。如果我們用編碼蛋白質序列而不是 DNA 序列來定義理論庫，那么非等同概率依然會出現。例如；當 “ NNN
”型密碼子編碼時，將會出現 6
個編碼亮氨酸的每一個密碼子出現的概率與唯一編碼甲硫氨酸密碼子出現的概率相等，因此在同一位點得到含有亮氨酸的蛋白質的概率將是得到含有甲硫氨酸的蛋白質概率的
6 倍。
在選擇壓力存在時，實驗開始時一般來說不可能精確數值定義出某些突變相關的選擇優勢或者劣勢。事實上，在有選擇壓力時最好反過來問問題：與其問給出特定的序列偏好，某種變種以何種概率出現，不如問在選擇出的子集中我們能夠觀察到的序列的實驗頻率。我們能夠確定這樣的頻率是否為期待的如
3.1.13 中的問題 C)，或者是否出現了偏差。
1 ) 我們這個非等同概率例子的特征
我們考慮在十肽中取樣。如果 10 個氨基酸在十肽中是隨機分布的（NNN) ，會有 2110=1.67X1013 種不同的理論變種（我們對待終止子與其他氨基酸相同）。因為密碼子的簡并性每種氨基酸以非等同概率被選擇；盡管如此，能夠發生的不同概率為下列 5 種：
其中
Met 和 Trp 分別被 64 個密碼子中的一個編碼；Phe、Tyr、His、Gln、Asn、Lys、Asp、Glu 和 Cys 分別被
64 個密碼子中的兩個編碼等。因此，上述 5 種概率所對應的氨基酸種類，分別為 2、9、2、5 以及 3 種氨基酸或終止密碼子。
2 ) 問題 A
在 n 個理論變種中選出 m 個，我們可以預計多少個不出現？
要解決這個問題，要素是考慮密碼子的簡并性。我們假定每個特異的十肽無論其氨基酸排列順序如何，都具有與其他相同氨基酸組成（因此具有同樣的簡并性）的十肽相同的出現概率。則問題 A 的答案是參數 λ ( 見注 7 )，計算式為
上述加和號是對所有 5 個數（n1、n2、n3、n4、n5）組成的數組的不同排序求和，相應于給定密碼子簡并性的 5 種概率。每個取自集合 { 0，1，2，…，10 } 的 “ 5 數組” 代表十肽中 5 種不同簡并度的氨基酸各占多少。因為我們只考慮 10 種氨基酸。例如，（n1、n2、n3、n4、n5）= ( 8，0，0，1，1 ) 意味著一個十肽中的 8 個位置是由非簡并氨基酸（1/64 ) 編碼，不包含簡并度為 2/64 和 3/64 的氨基酸，10 個位置中簡并度為 4/64 和 6/64 的氨基酸各有一個。
P（n1、n2、n3、n4、n5）可以計算為
這個 P（n1、n2、n3、n4、n5）是我們在 3.1 節開頭簡要介紹的 Pi 的一個新名字，意味著當我們從理論庫中隨機取樣一次，特定蛋白變種出現任意次的概率。
不幸的是，對于參數 λ 似乎不存在更簡單的表述；要計算 A 的求和必如利用計算機編程。
例如，我們要從理論庫 n=2110 ( 即約 1.67 X 1013；見圖 8.2 ) 中隨機取出 m = 1014 個十肽。
對于這組 m 和 n 的答案是 λ = 5.04 X 1012，因此我們預計從 1.67 X 1013 的理論庫中隨機取樣有 5.04 X 1012 個不出現，大概的比率是 30%。
3 ) 問題 B
樣本中至少有一種多肽變種不被產生出來的概率是多少？最多 50 或 60 種多肽變種沒有被取樣的概率是多少？
這樣的概率可以由 3.1.1 節中有關等概率事件方程（8.2 ) 得到；但是參數 λ 的值必須由方程（8.6 ) 計算。因此，至少一種多肽不被取樣的概率可以近似為（見注 5)。
計算 “至少” 或者 “最多” 特定數目多肽不被取樣的概率可由 8.3.1.12 ) 的方法得出，這里不再贅述。 .
例如，我們再次從理論庫 n = 2110≈1.67 X 1013 中隨機取出 m=1014 個十肽；并且在 8.3.1.1 的子節 2 ) 中求得 λ= 5.04 X 1012。顯然，對于 λ = 5.04X 1012 的預計缺失變種，直覺認為至少缺失一個的概率應該是很高的。利用式（8.8 )，我們確實可以求出此概率是 100%。換句話說，可產生出所有蛋白質變種的概率是 0%。
事實上，在所有多肽變種中最多 50 或 60 種不被產生的概率也是 0%。對于這樣的高 λ 值（5.04X1012 )，這樣的結果并不奇怪。
4 ) 問題 C
在一個樣本中，我們可以預計含有 7 個概率為 3/64 的密碼子和 3 個概率為 4/64 的密碼子的十肽會出現多少次？這樣的十肽出現 10 次的概率是多少？3 次呢？出現 10 次及 10 次以下的概率呢？
因為對于所有的在這個問題中所定義構成的肽來說，結果將會是一樣的，所以我們沒有必要去關心確切的序列（
比如氨基酸的次序和名稱 )。這些問題的答案只是在 8.3.1.1 的 3 )
中給出的問題中有微小的差別。因為對任意的十肽進行抽樣后一個十肽出現的概率為 P [ 見 8.3.1.1 的 2 )
]，這樣我們所預計的十肽出現的次數就是 mp，這里 m
是抽樣的次數。考慮到一些十肽會被抽樣超過一次，這樣概率將會隨著抽樣次數而增加，所預計的十肽出現一定次數的概率近似服從參數為 λ=mp
的泊松分布（參見注 3 和注 8)。
也就是說，我們可以期望在樣本中找到 λ = mp = 1014 X ( 1.21 X 10-13 ) ≈12.14 次這個十肽。出現十次的概率為
同樣的，特定的十肽出現 3 次的概率近似為 0.16%，遠遠小于出現 10 次的機會 ( 10% ) 。把小于 10 次的概率全部加起來，我們得到出現小于或等于 10 次的概率近似為 33% ( 圖 8.3)。
3.2 實驗偏差的檢驗
這一節的基本問題可以表述為具有兩個或兩個以上可能觀測值的試驗進行了多次，也就是，多次取樣的問題。每個觀測值的理論概率（預期的）是已知的，而觀測值的試驗概率可以通過觀察得到。理論概率和試驗概率間的差別是否是顯示實驗有顯著性偏差（biased) 的信號？
如節 8.1 中被提及的，在選擇之前或者之后，這樣的分析可以被常規地應用到 DNA 測序結果中測試偏差。應用下面提到的 X2 檢驗可以讓試驗者確定觀察到的偏差是顯著的還是不顯著的。
現在由以下記號來提出問題：一個試驗在理論上得到 k 個觀測值 A1，A2，…，Ak 的概率分別為 p1，p2，pk。例如，對一個蛋白質庫取樣可以得到 k = 2 個結果：有功能或非功能的。這個試驗被做了 n 次（也就是，n 個蛋白質被隨機地抽樣），則試驗結果在每個觀測值中出現的次數分別是 Y1，Y2，…， Yk 次。
X2 檢驗
X2 檢驗中的統計量為
我們要檢驗的假設，被稱作 “零假設”，是試驗以合適方式進行時的平均值，也就是說，以這一方式所得各個觀測值的概率符合它們的理論概率。一個大的 q 值表明真實的試驗結果與期望的結果之間存在顯著的差異，而與零假設矛盾。
把統計量 q 與參數為 k-1 在任意選擇的顯著性水平 α 下得到的值 Xα2 比較。參數 α 的值由使用者指定（關于顯著性水平見注 9) 。檢驗如下：
當 q＜Xα2（k-1) 時，接受原假設；沒有充分的理由認為存在偏差。
當 q＞Xα2（k-1) 時，拒絕原假設；有充分的理由認為存在偏差。
X2 分布的臨界值可以在大部分的統計學課本和很多軟件，如 Excel 中查到。
原假設（試驗以無偏好的正確方式進行）被接受（ 圖 8. 4 ) 。圖 8.7 描述了該假設具有應該被接受（17~33 個觀測值的特征）還是被拒絕（所有其他結果）的特征的觀測值個數。
表明統計量 q，以及對期望結果的不符合性不足夠大，因此我們可以得出結論認為在這個學生的操作步驟中存在瑕疵；而原假設沒法被拒絕。然而，如果我們取 α=10%，則 X0.102 ( 2 ) = 4.605，檢驗變成了：q = 5.6 > 4.605 = X0.102( 2 ) 這樣，我們能夠拒絕原假設，認為現在的試驗是所期望的。
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