構建蛋白質陣列文庫的第一步是建立全長cDNA表達文庫，再將cDNA文庫轉化成蛋白質文庫。原則上所有cDNA都可以用于蛋白質文庫的構建，然而大多數蛋白質因不具備體外可檢測的生物活性，因而不適于文庫篩選。能適用于體外高通量功能篩選的蛋白質主要有細胞膜“表面蛋白”和“分泌型蛋白”。
大部分分泌型蛋白質在氨基末端含有20至40個氨基酸的信號肽。而膜蛋白均含有跨膜疏水性的α螺旋結構。利用計算機程序可以預測這兩類蛋白，從而挑選相應的cDNA構建蛋白質陣列文庫。一旦cDNA文庫確定后，可將cDNA克隆到表達標記蛋白的載體內，應用高通量自動化的蛋白表達系統來表達和純化帶有標記的靶蛋白。