微陣列技術在單個實驗中能同時分析數千個參數。捕獲分子微點在固體支持物上固定成行列并暴露在含相應結合分子的樣品中。基于熒光、化學發光、質譜、放射性或電化學的讀出系統能檢測每個微點形成的復合物。這些微小化和平行的結合分析高度靈敏，方法的分析能力又能被微陣列基因表達分析所放大。在這些系統中，檢測固定的DNA探針的微陣列與互補靶分子的雜交程度。最近在蛋白質微陣列領域中的發展展示了它在酶-底物、DNA-蛋白質和不同類型蛋白質-蛋白質間相互作用中的應用。在本文，我們討論任何微小捕獲-分子-配體 分析系統理論上的優缺點，并討論蛋白質微陣列的應用將改變診斷方法和基因組和蛋白組的研究。
微小平行的微點配體結合分析的基本原理十年前就描述過。在“周圍分析理論”中，Roger Ekins 及其同事 [1–4]解釋了為什么微點分析比其他配體結合分析會更靈敏。那時，采用微小化的免役學分析系統已證明微點技術的高靈敏度和巨大的應用前景。但是，由微陣列引起的巨大興趣來自DNA芯片的工作。在一個有海量平行方式的反應中測定幾千個不同的結合反應的可能性完美地符合生物學中基因組方法的需要。全基因組測序方面的快速進展[5,6]和表達研究的漸增重要性[表達序列標簽測序]與有效的合成為配體結合分析特異的捕獲分子的體外技術正好匹配。寡核苷的合成和PCR的放大允許有效產生成千的高特異捕獲分子。主要是微技術和微流術的新進展建立了檢測系統，并且計算機技術與生物信息學的進展與微陣列分析系統快速整合。現在，其中一些是在每平方厘米的面積內放入幾千個不同的寡核苷探針的DNA微陣列，是能在單個實驗中能產生大量的成對基因組數據的建立良好的高通量雜交系統（見圖1）。
但是，從基因表達的研究中知道mRNA水平與蛋白質表達并不一定相關[7–9]。蛋白質功能常常依賴于前提蛋白的翻譯后處理，并且細胞通路的調節通常依賴蛋白質間的相互作用和/或諸如磷酸化的反向共價修飾而發生。一個細胞的蛋白組的分析（即所有蛋白的量化、它們翻譯后修飾的檢測和這些如何依賴于細胞狀態和環境的影響）沒有新實驗方法是不可能完成的。高通量蛋白分析方法需要一個快速、直接和定量的檢測方法。因此，需要努力擴大除DNA芯片的微陣列技術的應用并建立微陣列方法來描述蛋白組（見圖1）[10–12]。
微小配體結合分析：理論上的考慮
周圍分析理論表明微小配體結合分析能夠獲得超高靈敏度。一個采用少量捕獲分子和少量樣品的系統可能比一個采用100倍多的材料系統更靈敏。Ekins及其同事發明了一種基于微陣列的靈敏分析技術，并且證明其具有高靈敏性。有了這個系統，諸如甲狀腺刺激素(TSH)或乙肝表面抗原(HbsAG)的分析可以定量至毫微微摩爾濃度的范圍（相當于每ml含106個分子）。微小化是理解微小結合分析的關鍵。捕獲分子固定在很小面積的固相載體上，微點—盡管捕獲分子在系統中的數量小，但在微點中能獲得高濃度的分子（見圖2）。
在分析中，靶分子即分析物被微點捕獲，但是由于微點的小面積捕獲分子-靶分子復合物的數目低。結果是即使靶分子的濃度低而結合反應具有高親和力，但捕獲過程并不顯著改變樣品中靶分子的濃度。如果<0.1/K的捕獲分子被固定（K代表結合反應的親和常數），這就是事實。這些所謂的周圍分析物分析條件允許這樣的分析：從溶液中捕獲的靶分子或分析物的數量直接反應它在分析系統中的濃度。有趣的是：在周圍分析物條件下濃度的測量使得系統獨立于樣品的真實體積，而給出的結果卻兼容了高靈敏度與低樣品消耗。高靈敏度的獲得有兩個原因。第一，結合反應發生在最可能高的靶濃度。第二，捕獲-分子-靶復合物只在微點的小面積上，從而導致局部的強信號（見圖2）。捕獲分子以固定濃度固定在不斷增加體積的點上。隨著點的體積增加，在分析中的捕獲分子的總數增加，從小點獲得的總信號也增加。但是，信號濃度開始隨著小點體積增加而減小，因為靶數量開始成為一個制約因素。捕獲過程導致溶液中靶濃度的顯著降低，而同時探針-靶復合物分散在一個較大范圍。結果從小點的任何一點獲得的最大信號降低。減小微點的大小將降低每個微點的整體信號，但是對更小的微點信號濃度將增加（見圖2）。當微點大小小于某個值時，信號濃度將最優（周圍分析物條件，靶分子的數量沒有制約），并且將隨著微點大小的變小而大約恒定。因此，在微點上能獲得最高的信號強度核最優的信噪比。
微陣列技術
對DNA微陣列來說，預先合成的寡核苷酸或PCR-片段固定在固相支持物上，或在固相支持物直接合成寡核苷酸。從細胞中提取的靶分子，標記后與固定的互補捕獲探針雜交（圖3），然后測量和定量被捕獲的靶分子。DNA芯片技術利用大量的靶分子能在大量的平行測量中測定而樣品消耗低的事實。另外，用單個陣列可能完成兩個不同樣品的比較分析。在兩個樣品中的靶分子用兩種不同的熒光素標記，相同數量的樣品混在一起并與同一塊微陣列雜交。在每個微點上的兩個不同標記分子的比直接反應靶分子的濃度是相同或不同。
直接從DNA芯片技術轉變過來，Haab等對抗體-抗原微陣列采用相同的雙顏色標記程序（圖3）。他們采用一套110對抗原-抗體來制造免疫分析微陣列，以此作為不同蛋白分析概念的證明。固定抗體或抗原，而相應的靶分子在諸如血清的復雜溶液中用熒光標記。一個頭上有抗原的樣品標記成一種熒光，而包含不同濃度的抗原的另一個樣品用另一種熒光標記。兩種樣品混合后，與同一塊微陣列同時孵育。雙顏色檢測系統立即揭示被捕獲靶分子的不同濃度。依賴抗體的親和性，能夠檢測皮摩爾濃度的抗原。但是，蛋白質通常以復合物存在，結果一個微點的強信號可能來自大量的靶分子或捕獲一個大復合物。通常，他們的結果證明理論上可比較的分析方法能夠從DNA轉換到蛋白質。當從DNA轉換到蛋白質后，必須知道DNA和蛋白質是有不同理化特性的不同種類分子。DNA是由四種不同的核苷構成的單個分子，結構清楚，具有親水性、帶負電的糖骨架。相反，由20種不同的氨基酸組成的蛋白質產生不同特性的多樣分子。蛋白質有親水性的、不親水性的；有酸性的和堿性的；還有翻譯后修飾的（糖基化，乙酰化或磷酸化）。另外，蛋白質具有多樣的個體分子結構。此外，當固定在微陣列中時，捕獲蛋白質必須保持功能狀態。
抗體是用來確定靶分子的最重要捕獲分子。但是，由于生產單抗的繁重勞動，發展其他可替代物已成為十分必要。該領域最有希望的方法是與高多樣性結合的噬菌體展示技術，完全合成產生人工抗體的文庫。另一個策略是生產高特異性的寡核苷或aptamers多肽。這些分子的生產和選擇（如SELEX）應服從自動化和高通量捕獲分子的產生。MRNA顯示方法允許超多樣性的文庫的快速和有效生產，導致結合分子能結合幾乎所有nM–pM親和力的靶分子。正在發展的蛋白質微陣列領域需要發展生產重組蛋白的高通量生產方法。這些方法對成千的特異捕獲分子的不斷需求是個先決條件。只有這個困難得到解決，才能進行高濃度的蛋白質微陣列分析，而蛋白質微陣列分析是基于陣列的蛋白組學方法的主要工具。正在采取巨大努力來使重組蛋白的表達和純化自動化。已經在大腸桿菌和桿狀病毒系統中發展了生產大量平行重組蛋白的微小表達系統。已經生產了高密度融合蛋白的微陣列來篩選抗體特異性，也已經生產了高密度單鏈抗體文庫分析來確定適當的抗原。
Table 1.Classes of capture molecules
Capture molecules Source Technique Refs
mAb Mouse Hybridoma Reviewed in
[42,43]
scFv/Fab diabodies Antibody libraries Phage display, in vitro [16–19,
evolution 44–47]
Affinity binding agents Recombinant In vitro evolution [48]
fibronectin
structures
Affibodies Microorganism Heterologous expression [49,50]
Aptamers Library SELEX/mRNA display, [23,24,51–54]
(DNA/RNA/peptide) in vitro evolution
Receptor ligands Synthetic Combinatorial chemistry [36,55]
Substrates of enzymes Synthetic; pro- and Protein purification, [33,34,37]
eukaryotic recombinant protein
organisms technology (bacterial
fusion proteins,
baculovirus, peptide
synthesis)
Abbreviations: Fab, antigen-binding fragment; sc Fv, single-chain variable region fragment; mAb,monoclonal antibody.The table summarizes classes of molecules that have the potential to be used or are actually used as capture molecules in protein microarray systems. The sources they are from and the key technologies used to generate such capture molecules are listed together with selected relevant references.
重組蛋白除了用于合適捕獲分子的產生和分離外，它還用于制造允許快速有效的篩選高親和性的與其他蛋白有最小或沒有交叉反應的結合物的微陣列。捕獲分子的選擇性在所有基于微陣列的蛋白組學方法中是特別重要。
同時，為產生或完成DNA微陣列實驗的產品已經能夠商品化。市場上能提供DNA微陣列產品的公司已經超過100家（參見http://www.biochipnet.de）。這些技術設備能直接或稍加修飾就能用于蛋白質陣列的制造。大多數用于微陣列固定的支持物是玻璃，但塑料和多聚膜也可以。蛋白質的固定通常利用非共價的蛋白表面與憎水性（硝酸纖維素和聚苯乙烯）或帶正電荷（多聚賴氨酸和氨基硅烷）表面的相互作用。蛋白質微陣列的制造也常利用各種化學活化的表面（例如醛、環氧和活性酯）的共價吸附和特異生物分子的相互作用（例如鏈親和素-生物素、組氨酸-標簽-鎳-絡合物）。這些表面的微點是通過接觸印刷陣列儀采用小針頭將亞納升的樣品量直接放在表面制成的。另外，非接觸沉積技術是將毛細管或噴墨技術在表面沉積納升-皮升的液滴。
捕獲靶的檢測是通過電荷耦連設備（CCD）照相機或共焦檢測儀的激光掃描頭來完成的。另外，放射性、化學發光或無標記胞質共振檢測系統也可采用。表面加強激光解吸附和電離（SELDI）技術采用質譜儀作為輸出系統來分析微點陣列上的不同蛋白表達。不同來源的細胞提取物在相同的化學吸附表面（例如陽離子-陰離子交換材料，憎水性表面）的不同點孵育。未結合蛋白被洗掉以后，所有非特異性捕獲的靶蛋白能夠在SELDI質譜儀下分析。質譜展示捕獲蛋白的不同分子量。來自兩個不同樣品的兩套質譜數據立即鑒定出不同表達的蛋白。在某些情況下，不同顯示的蛋白能通過分子量立即鑒定。但通常這些蛋白必須通過親和層析富集，并且用已知的蛋白分析方法（如Edman測序、western雜交和digest mass fingerprinting）。
蛋白質微陣列
從理論上講，任何形式的依賴于固定捕獲分子和存在于周圍溶液的靶（結合物或分析物）的產物形成的配體-結合分析能夠微小化、平行化，并且在微陣列中完成。采用核酸-核酸相互作用（DNA芯片）的微陣列分析已良好建立，而蛋白微陣列分析剛開始普及。這個體現在最近關于核酸-蛋白，蛋白-蛋白，配體-受體和酶-底物的微陣列分析的文章中。
以微陣列形式研究DNA-蛋白的相互作用是Bulyk等人完成的，他們創造了雙鏈寡核苷的微陣列。單鏈寡核苷的高濃度微陣列是采用Affymetrix(Santa Clara, CA, USA)技術生產的。單鏈寡核苷微陣列通過酶延伸反應轉變成雙鏈寡核苷微陣列。這些分析與對不同DNA序列的特異限制性內切酶孵育。在與限制性內切酶孵育以前被酶甲基化的雙鏈DNA就沒有DNA的切割。一般而言，DNA-蛋白相互作用分析對DNA結合的蛋白如轉錄因子的定性和鑒定是有用的。
用于酶-底物分析的酶有不同種類，如限制性內切酶、過氧化物酶、磷酸化酶和蛋白激酶。在概念性證明實驗中，MacBeath and Schreiber將三種不同的激酶底物（每種底物對應一種特定激酶）固定在一塊平板玻璃表面。相同的微陣列一個對應一種激酶與放射性標記的ATP孵育。每種底物只被其特定的激酶磷酸化。在更高級的實驗中，Zhu等人分析了來自Saccharomyces cerevisiae的119種不同蛋白激酶對17種不同底物的活性。他們采用帶小孔的平板，其中底物共價結合在單個小孔中。表達為谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）融合蛋白的激酶在小孔中與底物和放射性標記的ATP一起孵育。當激酶反應結束后，激酶與ATP被洗掉，而陣列用磷酸成像儀分析磷酸化底物。采用這種方法，鑒定單個激酶的新活性。能夠磷酸化酪氨酸殘基的酶的序列比較顯示在他們的催化區域具有相同的氨基酸殘基。
對受體-配體分析來說，由組合的固相化學產生的小有機分子固定在微陣列中。從組合合成而來的單個樹脂珠放在96孔板中，而有機分子從珠中化學釋放出來。有機分子被稀釋、分散成小點，并且共價吸附在玻片上。這些由所謂的小分子印刷術產生的微陣列與熒光標記的靶蛋白孵育來確定新配體。這種技術使得在極低樣品消耗的情況下高通量的配體-受體相互作用篩選成為可能，這能夠改善制藥工業中活性底物的篩選。
在蛋白-蛋白相互作用分析的領域中，打點分析用于篩選固定蛋白與其他蛋白的特異相互作用。已經檢測出在放射性標記的人p52 GST融合蛋白和諸如核蛋白或從HeLa細胞中分離的絲氨酸-精氨酸蛋白片段的固定捕獲蛋白之間的特定相互作用。另外，也展示了DNA、RNA或低分子量的配體與固定分子的相互作用。這些陣列可以進一步微小化，因此有可能以微陣列的形式完成。
Zhu等人的最近工作證明對蛋白組學分析的陣列方法的非常能力。作者從S. cerevisiae中純化5800不同種重組蛋白后，生產了包含該微生物90%基因的基因產物的復雜蛋白芯片。這些微陣列能用于研究全基因組范圍內的蛋白-蛋白相互作用。利用鈣調蛋白作模型蛋白來探查陣列，能夠確證許多已知相互作用和測定一系列新的結合蛋白。這些蛋白的序列分析揭示存在一個結合基序，從而說明被發現的結合相互作用的重要性。用于檢測蛋白-脂質相互作用的實驗令人信服地說明鑒定能與低分子量復合物結合的蛋白是可能的。這就證實了直接從蛋白-藥物相互作用檢測整個蛋白組的可能性。
微陣列免疫分析對所有在一個樣品中平行分析幾個參數的診斷應用令人感興趣。我們采用微陣列技術來篩選抗原-抗體相互作用。諸如系統風濕等自身免疫疾病的常用診斷標志的18種不同抗原固定在微陣列中，允許平行測定不同類型的抗體。從1ml病人血清中可以高精確度地測定抗體滴度。夾心免疫分析也微小化、平行化并且可在微陣列中完成。這已被最近對生物樣品中不同細胞因子水平的高特異性和靈敏性的平行測定所證明。用陽性、陰性對照和/或內參照的蛋白微陣列可精確定量。這最終將導致堅固穩定的診斷分析的出現。
結論
上述例子表明蛋白微陣列技術已經是研究不同種蛋白相互作用的有用工具。陣列生產和分析完成的進一步發展和優化，與蛋白靶和配體的高通量產生結合后，將戲劇性地擴大蛋白微陣列應用的數目。蛋白組學研究和診斷應用將是蛋白微陣列技術的兩個主要應用領域。
在醫學研究中，蛋白微陣列通過平行分析所有感興趣的相關診斷參數將顯著加速免疫診斷。樣品體積的減少對那些只能獲得微量樣品的應用來說非常重要。一個例子是從微量活檢樣品中分析多個腫瘤標志。此外，在疾病治療中對病人的監測將發展這種新出現的技術。除DNA芯片的微陣列技術將加速蛋白-蛋白相互作用領域的基礎研究，也將描繪從蛋白的有限數量到高濃度的蛋白組學陣列分析的藍圖。蛋白和肽陣列將用于分析酶-底物特異性，也用于測定高度平行模式的不同底物的酶活性。
蛋白微陣列技術的整個領域展示了由不斷增加的基因組信息驅動的動態發展過程。諸如自動蛋白表達和純化系統的新技術用于捕獲蛋白的生產，分析全“蛋白組”的需要將驅動蛋白微陣列技術領域的快速發展。而故事才剛剛開始！