蛋白質技術——雙向電泳

實驗概要

蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心.  雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化.  雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離.  目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行。
 樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率.  用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用。對IEF(isoelectric  focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質.  理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%  CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換. 三丁基膦(Tributyl  phosphine，TBP  )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加。兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效。在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA)。除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎等.  另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性.  由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失。此外，低豐度蛋白(low  abundance  protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰。亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15  mg級的標準)、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性.  如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測。提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic  proteins)的分離是另一難點。由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生0～10%  的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之。亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性。

2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性。高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match)。對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric  focus)以O’Farrell’s技術為基礎. 第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte,  CA)，在管膠內建立pH梯度。隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移。2) NEPHGE(non-equilibrium pH  gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失.  因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized  pH gradient, IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題.  IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性.  目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH  4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離。

分離后的斑點檢測(spot  detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的.  此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性.  目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術.  銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感.  多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質檢測.  另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測。

較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術。

主要試劑

Acetic acid、 EtOH、  CBB、 瓊脂、  丙烯酰胺SDS 等

樣品提取液Ａ：10%三氯乙酸,0.07%β-疏基乙醇的丙酮溶液

樣品提取液Ｂ：0.07%β-疏基乙醇的丙酮溶液

樣品提取液Ｃ：9.5mol/Ｌ尿素,2%NP-40,2%Ampholine (1.6%pH5～8,0.4% pH 3.5～10),5%β-疏基乙醇

丙烯酰胺液Ｄ：28.38%丙烯酰胺,1.62%甲叉雙丙烯酰胺

凝膠平衡液Ｅ：10%甘油,0.1%β-疏基乙醇,4%SDS,0.1mol/ＬTris-HCl pH 6.8)

丙烯酰胺液Ｆ：29.1%丙烯酰胺,0.9%甲叉雙丙烯酰胺

分離膠緩沖液Ｇ：1.5 mol/ＬTris-HCl (pH 8.8),0.4% SDS

濃縮膠緩沖液Ｈ:0.5mol/ＬTris-HCl (ｐＨ6.8),0.4% SDS

電極緩沖液Ｉ：1% SDS,3.22% Tris,14.1%甘氨酸

考馬斯亮蘭染色液Ｊ：50%乙醇,5%冰乙酸,0.2%考馬斯亮蘭Ｒ-250

銀染顯色液Ｋ：6%Na₂CO₃,含0.5ｍＬ37%甲醛/Ｌ,4ｍｇNa₂S₂Ｏ₃·5Ｈ₂Ｏ/Ｌ  

實驗步驟

第一向（等電點聚焦，IEF）

1）凝膠條的準備

1．以帽凝膠端（2個校準環：4mm和10mm）朝下，將4根玻璃管插入兩個凝膠灌注裝置的每個托架中，這樣玻璃管恰好站在兩個分隔室之一的“充填船”上。從玻璃管頂端到玻璃管底端拉入PP線（小心，線不易移動），否則以后將不能用它們將膠溶液拉上來。

2．溶解分離膠溶液和過硫酸銨溶液。必須監控凝膠溶液的溫度，因為高溫下（大于25℃）聚合作用太快。

3．分離膠溶液除氣4分鐘，在桌子邊緣輕彈玻璃管壁，避免產生氣泡。

4．融化帽凝膠溶液，除氣，步驟同3。

5．用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分離膠溶液中，溶液應小心搖晃，避免氧氣進入膠內。

6．將分離膠溶液加到兩個凝膠灌注裝置的每一個充填船里（每4個管700μl）。所有的玻璃管末端都必須浸沒于凝膠溶液中。

7．小心將PP線抽出，將凝膠溶液拉上至23mm的標記。

8．換充填船分隔室。

9．使用一個Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝膠溶液中，輕輕振蕩使之混勻。

10．在兩個凝膠灌注裝置的每個充填船中的空余分隔室內加入200μl帽凝膠溶液；凝膠溶液應到達17mm的標記。

11．移去充填船，允許凝膠溶液到達13mm的標記。經過這一步，有空氣進入管子底端和4mm標記處。

12．聚合30分鐘后，將PP線抽出，去除凝膠表面未聚合的溶液。在毛細血管口部滴加一大滴去離子水，這樣在凝膠的上邊形成一個潮濕的室，在凝膠和水滴之間形成一個氣泡。用此方法形成一個潮濕的室，隨后用Parafilm膜封上帽凝膠一側。凝膠在室溫過夜，可以使之進一步聚合。制備好的管子如果保存于室溫，可以在第二天使用，或最遲在制備好第五天使用。

      2）加樣

1．將乙二胺加入陰極溶液，除氣5min，下槽裝陰極溶液。

2．融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl兩性電解混合液到100mg Sephadex膠中，在渦旋器上充分振蕩10～15分鐘。

3．從凝膠灌注裝置移走凝膠管，把它們插入聚焦槽的陽極部分，仍應看到13mm標記。帽凝膠一端朝上。

4．將陰極溶液加入管子的陰極一邊，不要有氣泡（事先已除去水）。

5．將聚焦槽的陽極部分安放到聚焦槽的底部，管子必須浸入陰極溶液。

6．除去水，并將加樣側干燥。使用一個伸長的巴斯德移液管或凝膠裝填移液管頭將水吸去，然后用濾紙條將凝膠表面干燥。

7．融解準備好的樣品和覆蓋溶液。

8．用凝膠裝填移液管頭，迅速在膠上覆蓋大約2mm厚的Sephadex。

9．用一個凝膠裝填移液管頭，裝入樣品（1～15μl），加到Sephadex表面。加樣時，尖端必須接觸Sephdex表層，樣品應小心加入，避免氣泡。

10．使用凝膠裝填頭，輕輕在樣品上加入5μl覆蓋液并分層，不要使覆蓋液和樣品相混合。然后在毛細血管中加入陽性溶液，不要引入氣泡。

11．所剩的陽極溶液加入上槽，用緩沖液覆蓋所有的管子。

     3）IEF電泳

電泳應分段升高以按下表獲得Vh（電壓×小時）乘積為1841：

凝膠平衡

1．融解平衡溶液（在IEF結束前1小時）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。

2．IEF結束后，移去管子中的陽性和陰性溶液。

3．用87％的甘油溶液覆蓋帽（cap）凝膠一側。

4．加5ml平衡溶液到Petri盤。

5．用PP線擠出凝膠：PP線從帽凝膠一側插入，管子加樣一側浸入去離子水，小心地向下擠出凝膠。與此同時可看到水中的覆蓋液的溶解。凝膠被拉出5min后，用水迅速清洗擠壓端。然后將管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盤子上，整個凝膠被PP線拉到盤子里。每個盤子里可平衡兩塊膠。

6．室溫振蕩平衡凝膠10分鐘整。

7．IEF之后，如果凝膠并不立刻使用，應倒出平衡緩沖液，并在Petri盤中－70℃保存。－20℃保存導致分辨率降低；液氮保存將破壞凝膠。

第二向（SDS－PAGE）

1）SDS-PAGE膠的制備

1．加熱瓊脂糖溶液至70℃使之液化。

2．冷卻瓊脂糖溶液至40℃，保持液態。

3．噴灑70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干凈。

4．融解凝膠溶液和APS。

5．將玻璃板夾入夾緊裝置，該夾緊裝置放在灌裝支架的前面狹槽中，這樣旋鈕對著支架，而“尖角”向上。充分旋轉旋鈕以使厚的有機玻璃正好對齊后部邊緣。這時大玻璃板可以放在有機玻璃板的前面，隔板沿著左邊和右邊的邊緣。插入小板，用拇指輕壓玻璃板和隔板以確使玻璃板位于底部。用鉗子夾緊做好的“三明治”，后部邊緣出現Newton環說明旋鈕已經非常緊了。不要將旋鈕旋得過于緊，否則玻璃板會被夾碎。將三明治從支架抽出，用拇指檢查玻璃板和隔板是否與底部齊平。

6．在小玻璃板底部起172.5px處做標記，做為加樣得輔助（凝膠長度為165px）。

7．將凝膠“三明治”裝置夾到灌裝支架上，旋鈕向內，“尖角”向上。在有機玻璃板上加壓以使凝膠三明治插入小突起下面。

8．將18ml凝膠溶液和1.2ml APS相混合，不要有氣泡。溶液必須混勻，不要引進氧氣。

9．含有凝膠溶液得容器放在加樣槽的后面玻璃板上，這樣凝膠溶液可以沿著加樣槽從玻璃板流下而沒有氣泡，分離膠被加到標記處。

10．迅速用去離子水覆蓋凝膠溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝膠一端用一巴斯德移液管防止攪動凝膠溶液，并使水在凝膠表面均勻地分層。60分鐘后，凝膠可以用于SDS-PAGE電泳。

 2）加樣

1．用濾紙條去除凝膠表面的去離子水。

2．將凝膠“三明治”放到電極裝置上（旋鈕沖外，尖角向上）：首先將凝膠“三明治”放到電極裝置的上面部分，向電極裝置擠壓它使下面一部分固定。

3．在平板凝膠表面加IEF凝膠：從平衡緩沖液中取出凝膠條，縱向放到厚有機玻璃板的邊緣，盡量使凝膠條與加樣槽的邊緣靠近。使用小刮勺，將凝膠條輕輕向下推，使之小心的滑入加樣槽。凝膠條必須位于SDS-PAGE的表面，沒有氣泡。

4．使用Pasteur移液管，將加樣槽加滿40℃的瓊脂糖溶液（沒有氣泡），2分鐘后，瓊脂糖溶液應凝固。

5．在電極裝置裝入凝膠“三明治”以后，將Bio-Rad槽注入620ml電極溶液，加溶液的時候避免泡沫和氣泡的形成。內槽中電極緩沖液面應到達電極裝置中紅塑料點的位置。

   3）SDS－PAGE電泳

1．在將槽封閉之前，需要確定有機玻璃表面是否干燥，以避免形成“漸進”電流，凝膠表面必須覆蓋電極緩沖液。

2．電壓必須如下表所示分段升高，電流和功率要調到電源的最大值。電流值如表所述并在每一部內逐漸減小。在給定的時間間隔初始和結束的數值如下表所示：

3．SDS-PAGE結束之后，倒出電極緩沖液，從電極裝置中取出凝膠“三明治”。輕微地彎曲隔板，將小玻璃板拉開以取出凝膠。凝膠可以轉移到固定溶液中。

4．固定之后，可以采用幾種染色方法。

注意事項

1．上樣量的問題，我覺得我跑的這張2D圖，上樣量還需要調整，可以適當降低，我的ipg膠條是13厘米的上樣量在50ng-80ng之間，上樣量不合適，豐度低的將會被豐度高的所遮蓋，這是最討厭的問題。

2、跑一向的時候大家都差不多，根據公司的說明就可以做了。跑二向的時候我現在一般做恒壓，以前做過恒流，沒感覺有什么差異，還想請教各位！橫流和恒壓到底哪個更好一些！

3、ipg膠條ph的選擇，我做的是植物的花藥，一般情況下酸性端點多一點，堿性端較少，我現在選用的是ph3-10的，我覺得很不合適，（不過這個膠條是免費的）因此好多點沒能很好的分開，如果膠條的ph小一點，膠條（我希望能達到450px）可是我們這里做不了，效果應該比這個好很多的！

4、從這塊膠上，我覺得致命點就是背景深，將影響我下一步的分析。所以銀染還需要改進！

5、針對不同的蛋白質，分離膠的濃度也是可以調節的，我比較懶，就作過10%，12.5%的，不過覺得都不適合。