確定沉淀蛋白質所需硫酸銨濃度的方法
將少量樣品冷卻到0～5℃，然后攪拌加入固體硫酸銨粉末，見蛋白質產生沉淀時，離心除去沉淀，分析上清液確定所要蛋白質的濃度，如它仍在溶液中則棄去沉淀，再加更多的硫酸銨于上清液中，直到產生蛋白質沉淀時止。以所要提取的蛋白質在溶液中的濃度對硫酸銨濃度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質開始沉淀的濃度。如不考慮收率，飽和度區間可取得窄一
些，使純度高一些。
鹽析時注意的幾個問題：
鹽的飽和度
不同蛋白質鹽析時要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組成的蛋白質時，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現一種蛋白質沉淀進行離心或過濾分離后，再繼續增加鹽的飽和度，使第2
種蛋白質沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質飽和度達20%時，纖維蛋白原首先析出；飽和增至28～33%時，優球蛋白析出；飽和度再增至
33～50%時，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時清蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液中分離得到9 種以上蛋白質及酶。
PH 值
pH 值在等電點時蛋白質溶解度最小易沉淀析出。因此鹽析時除個別特殊情況外，pH 值常選擇在被分離的蛋白質等電點附近。由于硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH 值低于7，如所要蛋白質遇酸易變性則應在適當緩沖液中進行。
蛋白質濃度
在相同鹽析條件下蛋白質濃度愈高愈易沉淀。使用鹽的飽和度的極限也愈低。如血清球蛋白的濃度從0.5%增至3.0%時,需用中性鹽的飽和度的最低極限從
29%遞減至24%.某一蛋白質欲進行兩次鹽析時,第1 次由于濃度較稀,鹽析分段范圍較寬,第2 次則逐漸變窄.例如膽堿酯酶用硫酸銨鹽析進時，第1
次硫酸銨飽和度為35%至60%,第2 次為40%至60%.
蛋白質濃度高些雖然對沉淀有利,但濃度過高也易引起雜蛋白的共沉作用.因此,必須選擇適當濃度盡可能避免共沉作用的干擾。
溫度
由于濃鹽液對蛋白質有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行。至于某些對熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質鹽析時對溫度要求不太嚴格。但在中性鹽中結晶純化時，溫度影響則比較明顯。
脫鹽
蛋白質用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。脫鹽方法最常用的是透析法。透析法所需時間較長，常在低溫下進行并加入防腐劑避免微生物污染。透析使用前必須處理，方法是將透析袋置于0.5mol/LEDTA
溶液中煮0.5h,棄去溶液,用蒸鎦水洗凈,置50%甘油中保存備用。也可用分子篩層析，常用SephadexG-25
柱層析法，上樣不要超過床體積的20%。
此外，有些金屬離子能和蛋白質形成較為專一的結合而使蛋白質沉淀。這雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質中有許多成功的例子。鋅離子在特定pH 下與胰島素結合形成沉淀就是這種例子。
蛋白質從懸浮液中沉淀出來的速度極慢，必須用強力離心來促進這個過程。
2、有機溶劑分離純化法
有機溶劑能降低溶液的介電常數，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度降低。有機溶劑與水作用能破壞蛋白質的水化膜，使蛋白質在一定濃度的有機溶劑中沉淀析出。常用的有機溶劑是乙醇和丙酮，由于有機溶劑的加入易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一般宜在低溫下進行，且在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以免局部濃度過大。用此法所析出的沉淀一般比鹽析法易過濾或離心沉降。分離后的蛋白質沉淀應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑的濃度。操作時的pH
值大多數控制在待沉淀蛋白質等電點附近。有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性和提高分離的效果。一般在有機溶劑沉淀時添加中性鹽的濃度在0.05mol
左右,過多不僅耗費有機溶劑,而且可能導致沉淀不好.沉淀的條件一經確定,就必須嚴格控制,才能得到重復性結果.有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度素示.故操作條件比鹽析法嚴格。
許多有機溶劑，如碳鏈較長的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后則分成兩相，一相以水為主，一相以有機溶劑為主。某些第3 組分的存在可以改變兩相的比例和組成。
有許多蛋白質在兩相中均能溶解，形成分配。在同一個兩相的溶劑系統中，不同的蛋白質有不同的分配系數。根據這一原理，操作全部機械化的有逆流分溶。因要求實驗室溫度恒定且操作也繁雜，雖一直有人在用但很不普遍。分配層析也是應用這一原理，但在分離純化蛋白質工作中用得不多，主要是因為多數蛋白質在有機溶劑中，特別是在易與水分相的溶劑中溶解度小且易變性。
疏水層析是近年發展的新方法。它利用蛋白質表面有一部分疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結合。洗脫時將鹽濃度逐漸降低，蛋白質因疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化。此法能分離其它一些方法不易純化的蛋白質。
利用分子形狀和大小不同的分離方法
蛋白質形狀有細長的如纖維，有密實的如圓球，形狀很不相同。蛋白質的分子量從6000左右開始，有各種大小，大的可以大到幾百萬。利用這些差別，有幾種方法可用來分離蛋白質。
凝膠層析：
屬最常用的蛋白質分離方法。系混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質因分子大小不同而被分離的技術。所指凝膠從廣義上說是一類具有三維空間多孔網狀結構的物質，如天然物質中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。把適當的凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內加入欲分離的混合物，然后用大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質的分子大小和形狀不同，在洗柱過程中，分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆
粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質在分離過程中的阻滯減速現象，有人也稱之為阻滯擴散層析、排阻層析等。
凝膠過濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過濾法之前，首先介紹分子篩的由來。McBain(1928)提出了分子篩的概念。后來發現這一現象在許多地方都存在。Synge
與Tiselins（1950）在解釋凝膠層中的電泳和電滲現象時引用了分子篩的概念。此后發現在柱層析中也有這種現象，于是許多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分離純化用的分子篩。至1959年Porath
與Flodim
找到部分水解的葡聚糖凝膠將其交聯，得到了商品名為交聯葡聚糖（Sephadex)的分子篩。該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質的分離分析中已被廣泛采用。
Lathe 與Ruthven(1956)曾利用分子篩效應測定過分子大小與分子量。Flodin
與Granath（1961）發現不同分子量的葡聚糖級分，其凝膠過濾行為與分子量大小有關。Andrew（1962）發現蛋白質中也有類似的性質.此后經過不少人的實際應用，完善了這一方法，形成一個可靠的測定高分子分子量的方法。
凝膠層析是60 年代初發展起來的一種快速而又簡便的分離技術。由于設備簡單、操作方便和不需要有機溶劑，以及對高分子物質有很高的分離效果，所以目前它已被生物化學、分子生物學、生物工程學及醫藥學等有關領域廣泛應用。