蛋白質標準曲線的制作（馬斯亮藍法）

一、實驗目的和內容
目的: 學習考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質濃度的原理和方法
內容：制作測定蛋白質濃度的標準曲線。
制作標準曲線是生物檢測分析的一項基本技術。一般用分光光度法測物質的含量，先要制作標準曲線，然后根據標準曲線查出所測物質的含量。考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍G－250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質通過范德華力結合，在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質結合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm吸光度可測定蛋白質的含量。另外，反應體系中呈現的顏色變化主要是G-250分子間疏水相互作用形成的聚集體聚集程度不同引起的。單體形式表現為藍色，單體和聚集體共存時表現為綠色，全為聚集體形式呈現為棕紅色。影響因素主要為溶液體系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。

蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2min即可反應完全，呈現最大光吸收，并可穩定1h，之后，蛋白質―染料復合物發生聚合并沉淀出來。蛋白質―染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質5μL/mL時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10－100μg蛋白質，微量測定法測定范圍是1－10μg蛋白質。此反應重復性好，精確度高，線性關系好。標準曲線在蛋白質濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質結合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。
此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當的緩沖液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X―100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當的緩沖液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。
二、實驗儀器和試劑
（一）試劑
1. 考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G－250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000mL,濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2. 標準蛋白質溶液：
純的牛血清血蛋白(BSA)，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
（二）器材
721型分光光度計、移液管（10mL）、移液槍、試管及試管架

三、實驗步驟

以A_595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標（六個點為20μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg），在坐標軸上繪制標準曲線。

1. 利用標準曲線查出回歸方程。

2. 用Excel作圖，測出回歸線性方程。即A595nm=a×X。相關系數一般大于0.9。

3. 未知樣品蛋白質濃度的測定：

測定方法同上，取合適體積的未知樣品，使其測定值在標準曲線的直線范圍內（0～100μg，最好在40～80μg），根據所測定的A_595nm，利用標準曲線或回歸方程求出相當于標準蛋白質的量（μg），從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/mL）。

一般被測樣品的A_595nm值在0.1—0.5之間，所以上述樣品如果A_595nm值太大，可以減少取樣量，如果仍然很大，可以定量稀釋后再進行測定。

四、注意事項：
（一）蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合的反應十分迅速，在2min左右反應達到平衡；其結合物在室溫下1h內基本穩定。如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5－20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩定的。
（二）測定中，蛋白－染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
1．Bradford法由于染色方法簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高，現已廣泛應用于蛋白質含量的測定。
2．有些陽離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質不干擾測定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴重干擾測定。
3．測定時僅使用一套比色杯（2個），并從低濃度到高濃度依次測定。中間不要用蒸餾水潤洗比色杯，僅用待測液潤洗2～3次即可。
另外，還要注意，玻璃。