蛋白質氨基端及羧基端序列分析實驗6

利用一維或二維聚丙烯酰胺凝膠分離的蛋白質或溶液中的蛋白質

乙酸酐 二甲基吡啶烷基化乙內硫酰脲 (ATH) 氨基酸標準品溴甲基萘的乙腈溶液考馬斯亮藍（R250）二異丙基乙胺（DIEA)的庚烷溶液乙酸乙酯甲醇N-甲基咪唑的乙腈溶液異氰酸苯酯的乙腈溶液哌嗪硫氰酸酯的乙腈溶液四丁基銨硫氰酸酯的乙腈溶液三氟乙酸（TFA)

氨基端測序儀氬氣燒杯羧基端測序儀加熱塊微型離心管培養皿PVDF 膜反應容器反相C18柱

一、將蛋白質轉移到 PVDF 膜上

步驟1 利用電印跡法或從溶液中直接吸收（利用 ProSorb 樣品制備容器），向 PVDF 膜轉移 50?IOOpmol 的蛋白質樣品。具體如下。

對于蛋白質電印跡到 PVDF 膜：

1.將凝膠中分離的蛋白質電轉移到一張 PVDF 膜上（見方案 2 和 Mozdzanowski,et al,1992)。

2.用考馬斯亮藍 R250(見方案 3) 浸染含有目的蛋白的 PVDF 膜。將膜在空氣中晾干。

實驗提示：可以用兩張紙夾住膜，掛在化學容器中或直接在工作臺上干燥，不過要在膜上蓋一張濾紙以防止污染。

3.切下目的蛋白條帶或點

如果不是立即進行分析，條帶/點可以在 -20°C 下保存幾個月。

4.如果需要同時進行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么進行步驟2，對固定在 PVDF 膜上的樣品進行氨基端測序；如果只需做羧基端測序，那么將結合在膜上的蛋白點放入 1.5 ml 微量離心管，進行步驟3。

對于將溶液中的蛋白吸附到 PVDF 膜（ProSorb):

1.用 5ul 的甲醇潤濕 PVDF 膜。

2.向樣品貯存器中加入 100ul 0.5% 的 TFA。

3.向樣品貯存器中加入 5~800ul 蛋白質樣品緩沖液。

4.如果樣品緩沖液中含有鹽分或其他低分子量雜質，用 100ul 0.1% 的 TFA 洗膜，洗 2 遍以上。

5.將內有 PVDF 膜的樣品貯存器嵌入到一個培養皿中，確保結合蛋白質的膜面朝上。

6.用一個玻璃燒杯罩住嵌入的膜（在貯存器中），將培養皿置于設為 60°C 的加熱塊上。完全干燥 PVDF 膜（約 20 min)。

目的是在 PVFD 膜干燥的過程中避免接觸空氣中的污染物，也避免燒杯接觸到膜。

7.小心地取出 PVDF 膜。

8.如果需要同時進行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么進行步驟②，對固定在 PVDF 膜上的樣品進行氨基端測序；如果只需做羧基端測序，那么將結合在膜上的蛋白點放入 1.5 ml 微量離心管，進行步驟③。

二、氨基酸測序

步驟2 依次進行氨基端和羧基端測序：

1.以 5~25 個循環進行氨基端序列分析。

2.將膜放入 1.5 ml 微量離心管，進行步驟③。

步驟3 準備羧基端測序的樣品:

1.向 PVDF 胰加人『1: 溶于庚 5%DIEA, 使庚練在 6(TC 蒸發約 Imin0

2.加人 5ul 溶于乙腈的 1% PIC，60℃ 溫育 5 min。

3.將帶有 PIC-衍生樣品的 PVDF 膜轉移到羧基端測序儀器中的反應器內。