蛋白質的測定凱氏定氮法

1)原理

樣品與硫酸和催化劑一同加熱后消化,使蛋白質分解,其中的碳和氫分別被氧化成二氧化碳和水蒸氣逸出,而有機氮轉化成氨后與硫酸結合生成硫酸銨,然后在堿性條件下蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再用硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即得蛋白質含量。以甘氨酸為例,該過程的反應方程式如下:

消化    2NH₂(CH₂)₂COOH+13H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄+6CO₂+12SO₂↑+16H₂O

蒸餾    (NH4)₂SO₄+2NaOH--2H₂O+Na₂SO₄+2NH₃↑

吸收    2NH₃+4H₃BO₃-(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

滴定    (NH4)2B4O7+2HCl+5H₂O  2NH₄CI+4H₃BO₃

在消化過程中,濃硫酸具有脫水性和炭化性,使有機物脫水并炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又有氧化性,使炭化后的碳氧化為二氧化碳硫酸則被還原成二氧化硫:

 2H₂SO₄-2SO₂+2H₂O+CO₂↑

二氧化硫使氮還原為氨,本身則被氧化為三氧化硫氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中:

 H₂SO₄+2NH₃-(NH₄)₂SO₄

在消化反應中,為了加速蛋白質的分解,縮短消化時間,常加入下列催化劑。

①硫酸鉀    加入硫酸鉀的目的是為了提高溶液的沸點,加快有機物的分解。硫酸鉀與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度,一般純硫酸的沸點為340℃左右,而添加硫酸鉀后,可使溫度提高至400℃以上,而且隨著消化過程中硫酸不斷地被分解,水分不斷逸出而使硫酸氫鉀的濃度逐漸增大,故沸點不斷升高,其反應式如下:

 K₂SO₄+H₂SO₄--2KHSO₄

 2KHSO₄-K₂S0₄+H₂O↑+SO₃

但是,硫酸鉀的加入量也不能太大,否則消化體系溫度過高,又會引起已生成的銨鹽發生熱分解析出氨而造成損失:

(NH₄)₂SO₄→NH₃↑+(NH₄)HSO₄

2(NH₄)HSO₄ 2NH₃↑+2SO₃↑+2H₂O

2CuSO₄ Cu₂SO₄+SO₂↑+O₂↑

除硫酸鉀外,也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點,但效果不如硫酸鉀。

②硫酸銅    硫酸銅在消化中起催化劑的作用。并且,藍色的硫酸銅溶液還可指示消化終點的到達,以及下一步蒸餾時作為堿性反應的指示劑。

除硫酸銅外,凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多,還有氧化汞、汞、硒粉等,但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素,應用最廣泛的是硫酸銅。另外,使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物的氧化分解。

2)主要儀器

凱氏燒瓶(500mL),定氮蒸餾裝置,如圖5-9所示。

圖5-9凱氏定氮消化、蒸餾裝置

1-水力真空管;2一水龍頭;3-倒置的干燥管;4一凱氏燒瓶;5,7一電爐;

6.9一鐵支架;8一蒸餾燒瓶;10進樣漏斗;11-冷凝管:12吸收瓶

3)試劑

①濃硫酸。

②硫酸銅。

③硫酸鉀。

④400g/L氫氧化鈉溶液。

⑤40g/L硼酸吸收液    稱取20g硼酸溶解于500mL熱水中,搖勻備用。

⑥甲基紅溴甲酚綠混合指示劑    5份2g/L溴甲酚綠95%乙醇溶液與1份2g/L甲基紅乙醇溶液臨用時混合均勻。混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。

⑦0.1000mol/L鹽酸標準溶液。

4)操作方法

準確稱取固體樣品0.2～2g(半固體樣品2～5g,液體樣品10～20mL),小心移入干燥潔凈的500mL凱氏燒瓶中,加入研細的硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL,輕輕搖勻,安裝消化裝置,并將其以45°斜支于有小孔的石棉網上。用電爐以小火加熱,待內容物全部炭化,泡沫停止產生后,加大火力保持瓶內液體微沸,至液體變藍綠色透明后,再繼續加熱微沸30min。冷卻,小心加入20mL蒸餾水,待完全冷卻后,加入玻璃珠數粒以防蒸餾時暴沸。

將凱氏燒瓶蒸餾裝置連好,塞緊瓶口,冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶內預先裝入50mL40g/L硼酸溶液及混合指示劑2～3滴)。放松漏斗夾子,通過漏斗加入70～80mL400g/L氫氧化鈉溶液,并搖動凱氏燒瓶,至瓶內溶液變為深藍色,或產生黑色沉淀,再加入100mL蒸餾水(從漏斗中加入),夾緊漏斗夾子,加熱蒸餾至氨全部蒸出(餾出液約250mL即可),將冷凝管下端提離液面,用蒸餾水沖洗管口,繼續蒸餾1min,用表面皿接幾滴餾出液,以奈氏試劑檢查,如無紅棕色物生成,表示蒸餾完畢,即可停止加熱。將上述吸收液用0.1000mol/L HCl標準溶液直接滴定至由藍色變為微紅色即為終點,記錄鹽酸溶液用量,同時做試劑空白(除不加樣品外,從消化開始操作完全相同),記錄空白試驗消耗鹽酸標準溶液的體積。

5)計算

式中    w——蛋白質的質量分數,%;

           c——鹽酸標準液的濃度,mol/L;

          V₀——空白滴定消耗標準液的體積,mL;

          V₁——試樣滴定消耗標準液的體積,mL;

          14——氮的毫摩爾質量,g/mmol;

           F——氮換算為蛋白質的系數;

           m——樣品質量,g。

6)說明及注意事項

①所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。

②消化時不要用強火,應保持和緩沸騰,注意不斷轉動凱氏燒瓶,以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全。

③樣品中若含脂肪或糖較多時,消化過程中易產生大量泡沫,為防止泡沫溢出瓶外,在開始消化時應用小火加熱,并不斷搖動;或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑,并同時注意控制熱源強度。

④當樣品消化液不易澄清透明時,可將凱氏燒瓶冷卻,加入30%過氧化氫2～3mL后再繼續加熱消化。

⑤若取樣量較大,如于試樣超過5g,可按每克試樣加5mL的比例增加硫酸用量。

⑥一般消化至呈透明后,繼續消化30min即可,但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品,如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時,需適當延長消化時間。有機物如分解完全,消化液應呈藍色或淺綠色,但含鐵量多時,呈較深綠色。

⑦蒸餾裝置不能漏氣。

⑧蒸餾前若加堿量不足,消化液在蒸餾時不生成氫氧化銅沉淀,此時需再增加氫氧化鈉用量。

⑨硼酸吸收液的溫度不應超過40℃,否則對氨的吸收作用減弱而造成損失,此時可置于冷水浴中使用。

⑩蒸餾完畢后,應先將冷凝管下端提離液面清洗管口,再蒸1min后關掉熱源,否則可能造成吸收液倒吸。