1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).
2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的?-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護（元素后數字為下標）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆－CH2SO3Hb、還原+氧化 不可逆[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等－S-CH2-COOHc、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆－R1-S-S-R2 + HSO3-R1-S- + R2-S-SOH3可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。巰基（-SH）的保護
圖1
作用：這些反應(見右圖1）可用于巰基的保護。
4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比（如右圖1）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。