目的要求
(1)學習Folin-phenol法測定蛋白質含量的原理及方法。
(2)制備標準曲線，測定未知樣品中蛋白質含量。
原理
目前蛋白質含量測定有兩類方法，一類是利用蛋白質的物理化學性質，如折射率、比重、紫外吸收等測定得知;另一類是利用化學方法測定蛋白質含量，如微量凱氏定氮、雙縮脈反應、Folin-phenol試劑法(又名Lowry
method)。Folin-phenol法的優點是操作簡單，迅速，不需特殊儀器設備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10-20倍，較雙縮脲法(Biuret
method)靈敏100倍，反應約在15min內有最大顯色，并至少可穩定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素千擾。在測試時應排除千擾因素或做空白試驗消除。
Folin-phenol試劑可由A試劑與B試劑組成。A試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質中的肢鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡合物。B試劑是由磷鋁酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質中酪胺酸的酚基還原呈藍色反應，其色澤深淺與蛋白質含量成正比。此法也適用于測定酪胺酸與色胺酸含量。
本法可測定范圍是25-250 μg蛋白質。
試劑和器材
一、試劑
1．標準蛋白質溶液
結晶牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)配制成標準液150 μg/ml 蛋白質溶液。
2．Folin-phenol試劑
二、測試樣品
三、器材
試管及試管架，0．5，1及5m1吸量管，恒溫水浴，分光亮度計
操作方法
一、制作Folin-phenol法標準曲線
取7支試管，依下表操作。
繪制標準曲線:以A650值為縱坐標，標準蛋白質含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| 標準蛋白質溶液/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸餾水/ml | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| Folin-phenol試劑/ml | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 混勻，于20-25 °C放置10 min，以蒸餾水為空白，在650 nm處比色 | |||||||
| A650 | |||||||
本實驗選用波長650 nm。請用Microsoft Excel 程序做圖及計算標準曲線如下圖(例):
二、測定未知樣品蛋白質濃度測定
| 空白管′2 | 樣品管′2 | |
| 未知濃度BSA溶液/ml | 0 | 0.2 |
| 蒸餾水/ml | 1.0 | 0.8 |
| Folin-phenol試劑/ml | 5.0 | 5.0 |
| 混勻，于20-25 °C放置10 min，在650 nm處比色 | ||
| A650 |
參考文獻