蛋白質濃縮和溶質的去除實驗

一、層析

在過去的 2 0 年中，蛋白質組學技術的日益廣泛應用，使蛋白質濃縮和脫鹽的層析技術得到不斷革新。蛋白質組學通常需要從少量復雜的混合物中富集蛋白質，包括選擇性地濃縮特定種類的蛋白質。由于質譜 (M S ) 和基于抗體檢測技術的高靈敏度及可提供詳細生化特征的性質，它們在臨床診斷、生物藥物鑒定以及蛋白質結構與功能的基礎性研究等廣泛的應用中具有很高的實用性。這些應用需要分析生物體液中含量很低的藥物靶標
和生物標志物, 或采集表達于異源系統的蛋白質的結構及翻譯后修飾的詳細信息。用于蛋白質組學分析的樣品通常來自于水溶液, 其中可能包含一系列不揮發的鹽類、溶劑、染料 、去污劑、離液劑、D N A / R N A 和脂類。這些污染物會降低高靈敏度分析技術的性能，尤其是對于電噴霧電離 (E S I) 基質輔助激光解吸/電離 (M A L D I ) 質譜 ，它們通過干擾樣品電離、形成加合物以及形成離子源污垢等對分辨率和靈敏度造成有害的影響。因 此 ，很多供應商已經開發出眾多用于目標蛋白質濃縮，并將它們從污染分子中進行高產率純化的微型固相萃取程序和設備。

1 凝 膠 過 濾

凝膠過濾基質已經被廣泛應用于在非變性情況下蛋白質的脫鹽。與小分子物質不同，大分子蛋白質不會進入這些樹脂的小孔中，從而在流動過程中將鹽分除去。通常情況下 ，填料體積是樣品體積的 4?2 0 倍, 同時柱長與柱徑的比值在 5?1 0 時, 層析柱的分辨率最佳。在脫鹽的過程中樣品最少被稀釋 1. 2 5 倍 ，但是，如果選擇合適的洗脫劑，即使樣品濃度在 ug/m L 的范圍內，其損失也可以說是微乎其微。由不同商家提供的基于多聚糖
的葡聚糖凝膠介質已經被廣泛應用于脫鹽，成 系 列 的 Bio-Gel P 丙烯酰胺基質 (Bio-R a d ，Hercules, CA) ，允許用戶根據目標蛋白質的分子質量定制介質的凝膠排阻極限。 ZebaSpin column (Thermo/Pierce， Rockford, IL) 提供了更多的方便，它能夠通過離心作用對分子質量大于 7000 D a 的蛋白質樣品進行快速脫鹽而不需要柱平衡和重力流分級分離 。通過選擇適當的柱子尺寸，可以對體積為 2?4000ul的濃度低至25ug/m L 的蛋白質樣品提供較高的回收率，同時對分子質量小于 1000 D a 的 分 子 具 有 高 達 95% 的 保 留 度 。 Zeba Spin m a t r i x 也可 以 以 9 6 孔板的形式使用，以方便同時對多個蛋白質樣品進行高通量的非變性脫鹽。

2 離 子 交 換 層 析

凝膠過濾蛋白質脫鹽的一種替代方法是使用混合床離子交換 (IE X ) 樹 脂 。大尺寸顆粒和表面修飾的混合床 IE X 吸著劑可以有效地捕捉小分子陰離子和陽離子(＜1000 Da),最小限度的截留高分子質量的蛋白質分子。脫鹽可以通過分批處理模式來實現，或通過一個基質填料床來實現。然而 ，這種技術一個不良的后果是: 在常規 IEX 吸附劑的混合床發生的離子交換可引起蛋白質樣品的酸化和沉淀。相比之下，用于牛奶和乳清脫鹽的
離子滯留基質，通過吸收而不是離子交換來進行鹽的攝取，因此，它可以在不發生顯著p H 變化的情況下完成蛋白質的脫鹽。可在市場上買到如 A G ll A 8 樹脂 (Bio-R a d , H e r -cules， CA) 。 類似于凝膠過濾，這些技術的缺點是在脫鹽過程中發生蛋白質樣品的稀釋，因此可能在后續處理時需要對蛋白質進行濃縮。

3 反 相 層 析

反相 (R P ) 層析是分離、脫鹽和濃縮蛋白質的一項很流行的技術, 一定程度上是由于樣品被濃縮在小體積的可通過蒸發而去除的揮發性溶劑中。伴隨著常規分析方法—質譜 (M S) 的到來，各種各樣的反相提取形式被商業化，以提高質譜技術操作過程的速度和便利度。這些形式包括微型離心柱、毛細管、微量加樣器吸頭和微孔板，用于對樣品量低至飛摩爾(femtomole) 級的蛋白質進行快速脫鹽，并洗脫在微升級體積之中。通常情況下 ，在 p H < 4 和有離子配對劑（如 〇.1 % ?I.0 % T F A )存在的情況下可使蛋白質和純化柱中的膠實現最佳結合。有機組分的存在可能會促進蛋白質與純化柱中的膠可逆結合，一般 為 15 % 的乙腈或甲醇，或離液劑（如鹽酸胍)等。如果含有去污劑類污染物，則可能需要對樣品稀釋以防止其干擾蛋白質與吸附劑的結合。脫鹽操作需要對樹脂進行清洗, 如使 用 5 % 的甲醇、1% 的 T F A 等; 通過用可替代的離子配對劑進行實驗可能會達到有選擇的洗脫。要根據蛋白質的大小對反相吸附劑進行選擇, 通常使用脂肪族的 C 4 、C 8、C 1 2 和C 18化合物。基于微量移液器的產品的一個例子是ZipTips (Millipore， Billerica, M A )，它用反相樹脂顆粒或N u T i p s (G l y g e n , C o l u m b i a, M D )填充, 吸頭的內壁用結合材料包被 ，因此減輕了反壓力, 將樣品與吸頭表面的非特異相互作用減少到最小。為了同時對多個樣品進行高通量脫鹽, 也可以將反相樹脂置于 9 6 孔板中，其中一個例子就是 ZipPlate模式 (Millipore， Billerica， M A )。

4 疏 水 和 親 和 層 析

除了常用的凝膠過濾、離子交換和反相吸附劑，可用的其他材料, 如分批的或置于微型設備中的樹脂可以支持多種模式的層析, 用于蛋白質的濃縮和脫鹽。這些包括疏水、親水 、金屬螯合、蛋白質親和樹脂。值得注意的是，當蛋白質樣品懸浮于一種有機溶劑并且需要去除污染的鹽分或去污劑的時候，親水介質為反相層析提供了一個有用的替代品。例 如 ，PAGE-P r e p 介質（T h e r m o /Pierce， Roc k f o r d, I L)，當蛋白質在5 0 % 二甲基亞諷存在的情況下與樹脂結合時，它 可 用 于 SDS-PAGE 分析前蛋白質的脫鹽。另 外 ，Glygen(Columbia， MD) 提供了微量移液器滴頭形式的親水介質 (N u T i p )。類似于反相介質，親水性樹脂的潛在缺點是蛋白質常常以變性的形式收回。相比之下，更重要的是固定化金
屬親和層析(I M A C )吸附劑的使用，以及最近包含有TiO₂的介質，已被有選擇的用于M S分析前對磷肽類的濃縮和脫鹽。這一技術在信號轉導研究領域具有特殊的應用，因為檢測低豐度的磷肽類對了解細胞的反應是至關重要的。最 近 的 一 份 報 道（Hsieh et al.，2007)描述了 T i O 2納米顆粒基質的制備，它能夠在可防止非特異性結合的含0.丨 ％ T F A和 5 0 % 乙腈( p H 2. 0) 的溶液中選擇性的結合磷肽類。在這種情況下，洗 脫 由 P H 8. 5 的100 m m o l /L 磷酸銨來完成，它與磷酸化肽類的 M A L D I -M S 等檢測相兼容，不需要進一步的脫鹽過程。

使用高效液相色譜(H P L C )技術為質譜(M S )分析準備蛋白質樣品的常規操作, 推動了供應商們去提供它們的吸著劑，成系列的柱子、套筒和毛細管等不斷出現并持續增加。這反過來又允許通過使用柱切換程序使樣品制備流線化。這種方法先用一個短的預裝柱進行蛋白質樣品的快速濃縮和脫鹽，接著可以通過使用一個長柱，在 同 樣 的 H P L C 系統對蛋白質進行高分辨率的分離。例如 ,P e p M a p 微量預裝柱(Dionex，Sunnyvale, CA ) 可用于蛋白質樣品的快速濃縮和脫鹽，其填充床的長度僅為5 m m 。由于樹脂使用的可選擇性 ，分析物的捕集效率由選擇的填料所支配，而樣品體積的減少改善了隨后層析步驟的分辨率。在此背景下，同樣值得評論的是，整體分離材料正被越來越多地用于對蛋白質的濃縮和脫鹽 (Schley et al., 20〇 6)。高 達 20um的有效孔徑允許溶質快速傳遞透過整體基質。相比較于在基于顆粒吸附劑的亞微米級孔隙內實現的由較慢的擴散作用所介導的液相傳質，整體介質可以實現在高流速低反壓力條件下的高效分離，特別有益于通過柱切換進行快速脫鹽。然而 ，在一個更直接的方法里，Mass-Prep c o l u m n (Waters ， Milford，M A )已被用于對疏水性基質中蛋白質的在線脫鹽, 樣品可直接注人E S I 質譜儀中( W h e a t
etal.， 2007)。此外，M A L D I -M S 分析的樣品制備可以在不需要微量提取裝置的情況下執行。所以 ，在將蛋白質分別加載到M A L D I 板之前，眾多吸附劑已被用于對樣品進行分批脫鹽。最近發展的一個例子是Z n O 多 聚（甲基丙烯酸甲酯）納米顆粒吸附劑，在進行M A L D I -M S 之前可以從蛋白質樣品中消除飽和水平的N a C l (6.2 m o l /L )、N H ₄ H C O ₃(2. 6 m o l /L ) 或 I m o l /L 的 尿 素（S h e n et al. ， 2008)。相似的，脫鹽作用通過使用一個疏水基質直接加入M A L D I 板的板孔中而實現(Jia et d . ， 2007)。在這種情況下，目標蛋白質被基質捕獲, 接著通過使用一個最小限量的板上清洗實現樣品的干燥、脫 鹽 ，此時樣品已可以進行M A L D I -M S 分析而不需要進一步的純化。

5 生 產 規 模 的 層 析

類似于分析用的小規模提取，制備規模和生產規模的蛋白質回收往往包括濃縮和脫鹽 。柱層析仍然是蛋白質純化的核心技術，這歸因于其可實現的高選擇性，同時具有方便耐用的填充樹脂床，原料在樹脂中通過流動而進行傳送。商業化生產酶和生物藥品通常需要加工數千升的初始原料。為了盡量減少操作的復雜性，減少加工時間，同時有效的控制成本，可能有必要在下游操作過程的早期對原料進行濃縮，去除大部分雜質和不必要的鹽分。這可以通過使用直徑達2 m 的大的樹脂層析柱床經結合-洗脫層析來實現, 其產生
的洗脫組分小于上樣體積。此外, 可開發選擇性的樹脂，用以純化相應的蛋白質產品。一個 著 名 的 例 子 是 使 用 Protein A 親 和 樹 脂 來 生 產 哺 乳 動 物 細 胞 所 表 達 的 抗 體 蛋 白 。在親和 捕 獲（由 目 標 分 子 F c 區 域 的 特 定 表 位 所 介 導 )過 程 中 ，大 部 分 培 養 基 復 合 物 、鹽 類 及 雜質 通 過 柱 子 而 流 穿 。產 品 回 收 通 常 是 通 過 使 用 低 P H 的 洗 脫 液 進 行 洗 脫 而 實 現 的 , 洗 脫產 物 一 般 會 減 少 9 0 % 的 體 積 。新 一 代 的 protein A 親 和 樹 脂 已 被 優 化 ，主 要 表 現 在 配 體的 密 度 、顆 粒 的 結 構 及 傳 質 特 性 等 ，以 使 動 態 結 合 能 力 達 到 最 大 ，同 時 最 大 限 度 的 減 少 柱循 環 。這 反 過 來 又 最 大 限 度 的 減 少 了 中 間 體 積 ，同 時 在 整 個 過 程 的 第 一 步 對 樣 品 流 進 行了 有 效 的 濃 縮 。對 于 樹 脂 ，典 型 的 例 子 是 MabSelect (GE Healthcare, Piscataway， NJ)和 ProSep Ultra Plus (Millipore， Billerica， MA) ，它 們 的 結 合 能 力 是 每 升 樹 脂 2〇 ? 5O g蛋 白 質 ，這 種 結 合 能 力 的 實 現 依 賴 于 目 標 蛋 白 質 的 性 質 及 其 在 柱 加 載 過 程 中 與 樹 脂 的 接觸 時 間 。傳 統 的 層 析 樹 脂 ，包 括 IE X 和 疏 水 作 用 層 析（HIC) 吸 附 劑 ，也 經 歷 了 同 樣 的 優化 ，體 現 在 粒 度 、孔 隙 的 大 小 和 配 體 密 度 等 ，以 實 現 對 特 定 分 子 質 量 范 圍 內 分 子 的 最 高 結合 能 力 ，同 時 能 夠 進 行 高 效 的 洗 脫 。例 如 ToyoPearl GigaCap S-650M(Tosoh Biosciences, Tokyo, Japan) 是 一 種 陽 離 子 交 換 樹 脂 ，已 經 被 優 化 用 于 捕 獲 分 子 質 量 約 為150 kD a的 Ig G l分 子 ，它 具 有 高 動 態 結 合 能 力 ( > 1 0 0 g/L 樹 脂 ），同 時 允 許 以 最 小 限 度 的洗 脫 體 積 進 行 回 收 ，通 常 是 2?3 個 柱 體 積 。最 后 ，混 合 模 式 的 吸 附 劑 已 被 開 發 , 該 模 式 允許 IEX 層 析 在 電 導 率 相 對 較 高 的 情 況 下 進 行 高 能 力 的 結 合 ，它 通 過 將 IEX 和 疏 水 基 等 量的 結 合 到 相 同 的 配 體 而 實 現 。其 中 的 一 個 例 子 是 Capto M M C 樹 脂（GEHealthcare，
Rscataway， NJ) ，它 結 合 了 一 個 陽 離 子 交 換 和 疏 水 基 團 ，在 電 導 率 為 30 mS/cm 的情況下對 牛 血 清 白 蛋 白 的 結 合 能 力 為 每 毫 升 樹 脂 45 mg。這 一 屬 性 是 特 別 有 用 的 ，因 為 , 最佳的蛋 白 質 純 化 過 程 通 常 需 要 通 過 使 用 多 個 正 交 模 式 的 層 析 來 實 現 ，它 需 要 使 用 分 開 的 步 驟來 執 行 ; 而 保 持 原 料 的 電 導 率 在 某 一 個 水 平 上 ，在 不 稀 釋 的 情 況 下 能 與 傳 統 的 IE X 步驟相 兼 容 是 非 常 具 有 挑 戰 性 的 。因 此 ，雖 然 這 種 類 型 的 吸 附 劑 可 能 不 直 接 對 物 料 進 行 濃 縮 ，但 它 可 能 會 減 少 下 游 處 理 過 程 中 因 需 要 減 小 電 導 率 而 進 行 的 稀 釋 。混 合 模 式 樹 脂 更 大 的吸 引 力 在 于 它 可 以 提 供 獨 特 的 選 擇 性 ，這 可 能 會 提 高 整 個 純 化 過 程 的 效 率 。

二、電泳

通 過 凝 膠 電 泳 進 行 蛋 白 質 濃 縮 通 常 應 用 于 其 隨 后 的 分 析 技 術 中 ，用 以 增 強 靈 敏 度 。例 如 ，蛋 白 質 印 跡 法 (Western Blot) 的 靈 敏 度 可 通 過 應 用 高 達 250 uL 的 蛋 白 質 樣 品 ，在微 型 凝 膠 系 統 1? 2 cm 的 積 層 膠 上 連 續 進 行 5 次 以 上 的 加 樣 而 得 到 增 強 (Sheen and AliKhan, 2005)。這 種 方 法 可 實 現 有 效 的 樣 品 濃 縮 ，垂 直 譜 帶 增 寬（band broadening) 是它唯 一 的 人 為 痕 跡 。在 Western B lo t 之 前 對 稀 釋 樣 品 進 行 類 似 的 濃 縮 可 通 過 一 個 漏 斗 狀的 上 樣 孔 來 完 成 。毛 細 管 電 泳 法 (CE) 可 通 過 堆 積 作 用 而 實 現 蛋 白 質 樣 品 的 濃 縮 (參 見
Shihabi，2002)。此 外 , 最 近 的 一 項 報 道 描 述 了 同 時 進 行 蛋 白 質 濃 縮 和 脫 鹽 的 毛 細 管 電 泳條 件 。這 是 一 個 顯 著 的 技 術 進 步 ，因 為 蛋 白 質 在 毛 細 管 電 泳 之 前 通 常 需 要 進 行 脫 鹽 ，鹽離子 可 通 過 焦 耳 熱(Joule heating) 和 電 分 散 等 效 應 導 致 譜 帶 增 寬 。此 外 ，當 毛 細 管 電 泳 樣品 的 離 子 強 度 比 電 解 液 低 時 ，可 達 到 一 個 理 想 的 疊 加 效 果 ，從 而 導 致 蛋 白 質 富 集 并 提 高 分析應用的靈敏度。在毛細管電泳前對蛋白質脫鹽可通過標準的反相提取來實現。雖然可以在毛細管電泳實驗過程中進行在線脫鹽的固相微型床已有報道，然而這種方法可能在技術上仍非常具有挑戰性, 所以脫鹽通常是作為一個分離步驟來執行的。為了克服這些缺點，開發了一種被稱為毛細管等電阱的新技術，在毛細管電泳過程中可同時進行蛋白質樣品的濃縮和脫鹽 (Booker and Yeung, 2008)。 這種方法使用了不連續的緩沖系統，在毛細管內建立了穩定的 p H 邊界。靜止的邊界在 p i 處捕捉兼性離子的蛋白質，同時消除
了污染的離子鹽類, 這些鹽類由于具有恒定的電荷而繼續遷移。這一技術有利于回收濃縮和脫鹽的蛋白質樣品，并 用 于 M S 或緊接著切換到另一種緩沖系統中，允許對濃縮了的蛋白質進行毛細管區帶電泳分析。最后 ，微流體裝置越來越多的找到了它們在生化分析前樣品制備中的實用性，部分原因是由于它們能夠通過使用一個電場對小量蛋白質樣品進行快速的濃縮和脫鹽 [如參見 Y u 等 (2008)]。

三、透析

透析是基于分子質量大小的液相分離技術，它由透過半透膜的選擇性擴散來實現。這種技術被認為是從大分子蛋白質中去除小分子溶質的最流行方法。特別是，這種非變性的脫鹽技術允許在良性或生理條件下更換緩沖液，其影響目標蛋白質性質的風險可降到最低限度。

過去的十年里，透析的原理并沒有改變，但用于透析的技術和工具卻得到了改良。尤其 是 優 化 的 技 術 實 現 了 高 通 量（減 少 處 理 時 間 ），增 加 了 處 理 樣 品 體 積 的 靈 活 性（從1 0 uL ? 100 m L ); 改進了的透析膜形態減少了蛋白質的吸附和損失，提高了樣品處理的方便性。

通常情況下，目的緩沖液 (透析液）的體積要比蛋白質樣品的體積大若干個數量級。樣品被轉移到一個密封艙內，暴露于充當半滲透屏障的透析膜。透析膜通常具有特定的孔徑, 即截留分子質量 (M W C O )，它允許分子質量小于這一限度的分子雙向自由通過，而大分子物質 (如蛋白質) 則被截留。透析膜兩邊的緩沖液濃度梯度驅動溶質從濃度高的區域向濃度低的區域擴散 (圖 9. 1)。擴散運輸的流量可以用菲克擴散定律來描述。

有幾個方面可以影響透析產品的穩定回收, 包括緩沖液交換所需的時間、透析系統的設計以及透析膜的化學和形態學特征。完成緩沖液交換所需要的時間取決于幾個因素。可以通過提高分子穿過半透膜的固有擴散作用以減少透析過程的時間。基于前述的方程 ，物質轉運可以通過增加膜面積或溶質的流量而得到提高。當樣品體積很小時, 可以很容易的得到樣品相對于透析液的一個很大的比率。然而, 蛋白質可吸附到透析膜而導致損失。在這樣的背景下，需要評價增加膜面積或增加時間 (對于較小的膜面積) 所產生的影響。由于溶質的擴散系數隨溫度而變化，溫度升高將加快分子運動，增加內在的擴散系數 ，從而導致更快的轉運。然 而 ，升髙溫度會對樣品的穩定性產生不利的影響。由于樣品的完整性往往是最重要的，因此可能需要預先確定能保持蛋白質穩定的最高溫度。

透析系統的設計也可以決定進行有效透析的時間和產品回收的效率。溶質從樣品中穿過膜擴散進入透析液的邊界層。邊界層中溶質的濃度髙于透析液中其他部位溶質的濃度 ，從而減少跨越膜的濃度梯度，抑制擴散的進行。然而 ，可通過介導透析液的對流流動或通過不停的攪拌來減小邊界層。

當前，透 析 膜 和 透 析 管 的 機 械 設 計 使 其 可 以 對 范 圍 廣 泛 的 樣 品 量（從 10 uL ?100 mL) 進行加工處理, 其產品的損失可以忽略不計。傳統的透析管在其可使用之前要經歷復雜的準 備 。 Pierce Biotech (Rockford， IL) 提 供 的 SnakeSkin?透析管可以簡化大體積樣品的透析。這一技術的核心為褶狀的再生纖維素膜 (3. 5? 10 kDa M W CO)，便于快速 準 備 。在小體積樣品透析的情況 下 ， Pierce 提 供 了 簡 潔 的 SlideA-Lyzer?微型透析
器 (10? 100 uL ) 和透析盒（0.1? 30 m L ), 用于處理有限的小量生物樣品。 這些透析器是一 次 性的杯子，由聚丙烯和再生纖維素制成，使用標準的實驗室移液器可以很容易地移取樣品。新的設計提高了對寶貴的小量樣品的回收率。

1 濃 縮 和 親 和 結 合 的 應 用

蛋白質緩沖液交換的應用主導了透析膜的使用。然而 ，透析技術在濃縮和大分子親和結合相互作用領域的應用越來越多。

使用透析膜進行蛋白質的濃縮類似于雙水相萃取，通過使用試劑（ 如聚乙二醇、葡聚糖等聚合物) 產生一個雙相系統, 而透析膜則將這個兩相分開 (Waziri etal. ， 2004)。根據該系統的設計，蛋白質可以自由的通過膜并與沉淀劑相互作用，隨后得到濃縮，同時產品也得以回收。

這項技術被稱為平衡透析, 它也被用于在血清結合測定中對候選藥品的鑒定，研究抗原-抗體相互作用，以及評估使用其他方法無法檢測的低親和力相互作用。在平衡透析中，膜的選擇需要滿足以下條件: 所需的蛋白質或配體可以自由通過; 受體分子只能位于膜一邊 ，且不能透過。當蛋白質擴散穿過膜時，其中的一些蛋白質將結合到受體上，而有些蛋白質則仍保留在溶液中。配體穿過膜并結合到受體上的擴散作用會持續進行，直到達到平衡。
配體槽中自由配體的濃度也可以用于檢測樣品的結合特性 (Waters et al. ， 2008)。

四、超濾

超濾 (U F ) 所利用的分離機制本質上相當于透析。兩種技術都采用半滲透屏障或膜將樣品 (包含有所需的產品或溶質) 從溶液中分離開來。膜的設計允許小分子質量的溶質(如鹽) 滲過，而所需的產品則完全保留下來。超濾膜非常適用于濃縮生物制劑，因為它們可以在一個較寬的溫度范圍 (2?26°C ) 內操作，而且不涉及相變化或化學添加劑，從而最大限度地減少了不穩定生物制品的變性和/或降解。將超濾與透析區分的作用有 3 個:①
應用;②操作模式;③膜的結構。首先，透析主要用于溶質或緩沖液的交換, 而超濾則應用于緩沖液交換或產品的濃縮。其次 ，透析是通過由半透膜兩邊的濃度差所驅動的擴散傳作用而進行的，而超濾主要是由膜兩邊的壓力差所驅動的傳統的傳質而起作用的。由于使用不同的驅動力進行溶質或溶劑的轉移，用于超濾的膜的機械強度要比透析膜的大。壓力驅動的超濾膜的設計可承受超過 75 psi①的高壓力差。

一 般 情 況 下 , 有 3 種 模 型 方 法 已 被 用 于 描 述 通 過 超 濾 進 行 溶 質 轉 運 的 真 實 機 制(Denisov， 1994)。其 中 的 一 種 超 濾 轉 運 機 制 如 圖 9. 2 所 示 。由壓力 驅 動 的 液 流 促 使 溶質 和 溶 劑 向 膜 的 上 游 表 面 傳 遞 并 透 過 ，所施加 的 壓 力 差 被 稱 為 跨 膜 壓 力（△P _tm ) 。如 果 膜可 以 完 全 保 留 住 一 個 給 定 的 溶 質（如 蛋 白 質），就 如 同 通 過 超 濾 進 行 濃 縮 的 情 況 一 樣 ，C _濾出液=0, 保 留 下 的 溶 質 將 在 膜 的 上 游 表 面 積 累 ，將 導 致 膜 表 面 在 邊 界 層 厚 度 δ 內 的 濃 度增 加 。這 種 現 象 稱 為 「濃 度 極 化 “(concentration polarization)。 溶 質 在 膜 表 面 的 積 累 會 通過 幾 種 機 制 影 響 溶 劑 過 濾 通 量 (J v) 。首 先 ，積 累 的 溶 質 可 以 產 生 一 個 沿 著 膜 的 滲 透 壓 力差 ，驅 動 液 流 從 濾 液 向 原 料 或 滲 余 物 的 方 向 流 動 ，從 而 減 少 溶 劑 運 輸 的 凈 速 率 。對 通 量 的描 述 見 下 文和圖 9. 2。

總 體 而 言 ，這 些 模 型 可 以 讓 用 戶 更 好 地 了 解 超 濾 工 藝 參 數 對 溶 質 和 溶 劑 流 量 的 影 響 ，并 可 以 依 此 優 化 條 件 來 提 高 膜 的 通 量 。這 些 模 型 最 重 要 的 應 用 可 能 是 開 發 設 計 可 進 行 大規 模 濃 縮 的 超 濾 系 統 ，對 昂 貴 的 產 品 (如 用 于 疾 病 治 療 的 蛋 白 質 ) 進 行 濃 縮 ，在 此 ，濃 縮 工藝 的 生 產 力 和 回 收 率 都 是 至 關 重 要 的 。而 對 于 實 驗 室 規 模 的 超 濾 , 這 些 因 素 不 是 最 關 鍵的 ; 但 在 用 于 小 規 模 制 備 的 超 濾 系 統 的 設 計 中 應 該 考 慮 這 些 因 素 。

1.超濾膜

一 般 情 況 下 ，大 多 數 超 濾 膜 包 含 一 個 堅 固 的 支 撐 結 構 (如 T y v e k ? ) ，并 在 這 一 基 礎 上附加了一個非常薄的聚合物層。實際上正是這一薄層提供了選擇性通透膜所需的性質，并決定了流阻。用于超濾的膜的生產技術在過去幾十年里都沒有改變。然 而 ，在膜孔徑分布、膜形態和膜修飾等的控制技術方面已經有了顯著的改善。超 濾 膜 的 3 個主要鑄造技術分別是空氣鑄造、浸漬鑄造和融化鑄造。它們的區別主要在于去溶劑化的方法和設備上 ( Z e m a n and Z y d n e y , 1996)。目前的膜成分可以適應多種聚合物，這些聚合物可以通過接合、融合、涂敷等方式與超濾膜形成共聚物，從而提高了化學和機械穩定性。纖維
素型聚合物提供許多生物技術應用所需的低蛋白質結合。然 而 ，纖維素型膜在暴露于堿性次氯酸鹽清潔液時一般會降解。新型纖維素復合膜 (如 來 自 Mllip0r e 公 司 的 Ultracel?)具有低污染和低蛋白質結合的能力, 從而實現優良的產物截留、回收的性質及更高的產率 。這 些 Ultracel 膜是將可再生的纖維素膜鑄型于多孔性材料襯底上而構成的，相比于傳統的膜，這些無缺陷的膜具有優良的穩固性。復合材料技術提供了一個機械強度極高的設計，可耐受極端的操作條件。此外, 聚砜 (P S ) 和聚醚砜 (P E S ) 高分子膜具有充分的抗堿能力，可以應用于需要用 N a O H 清洗的情況，但它更容易被含有生物制品的溶液所污染 。表面修飾已成為用于減少膜污染的最通用的方法。膜修飾通過使用帶負電荷的單體來完成 (R o n g e t a l ., 2006)，或利用中性聚合物將高分子膜親水化。幾個主要的膜供應商 ，如 Millipore、 Pall Corporation、 Gelman Sciences、 Sartorius 和 Sterlitech 提供了 品種多樣的改良多聚體膜和陶瓷膜, 可以分別滿足各種小規模和大規模情況下的生物學應用。

2. 超濾裝置

如前所述，目前的超濾膜和相關的設備可用于溶質或緩沖液交換，并對所需蛋白質進行濃縮。絕大部分小規模的超濾膜設備設計成盲端操作的模式，而大規模的超濾系統采用切向流操作模式(圖 9. 3)。

于漏斗中，在真空作用驅動下透過膜進入到收集容器中。
(2) 針頭式濾器超濾膜與塑料支撐板結合并封閉于小的盤狀單元中，它配備有魯爾 (Luer) 接頭, 可以連接到注射器上。將注射器充滿樣品，手動驅使濾過液透過濾器以濃縮樣品。

(3) 離心式過濾器 膜 盤 放 置 于 小 的 離 心 管 中 ，滲透物收集于膜下管底部的空間里。樣品通過離心力驅動穿過超濾膜，濃縮了的樣品保留于膜上部。 Pall Corporation 提供了寬濾過范圍的離心式超濾膜 (N a n o s e p? 、MicroSep? 、M a c r o S e p? 和 J u m b o - Sep? ) ，用于處理小 于 I m L 到大 至 60 m L 的樣品，它們包含有 O m e g a ? 改 良 的 P E S 膜 ，其截留分子質量 (M W C O ) 為 10?100 K 。 Millipore 公司提供了一次性的Centriplus? 離心式過濾設備 ，通 過 A m i c o n 的低吸附性親水膜，用 于 2?15 m L 樣品的濃縮（100 倍) 和脫鹽。這些裝置設計可用于能容納 50 m L 離心管的大多數離心桶式的或固定角度轉頭的離心機。最后指出，Millipore 公司 的 A m i c o n Ultra-4 離心機過濾器，它們被設計成能夠精確的濃縮 (80?100 倍) 小體積 (1?4 m L ) 樣 品 ，可以用于處理和回收非常寶貴的生物制品。

(4) 多孔濾板超濾膜整合至 9 6 孔 或 384 孔的多孔過濾板中，用于小樣品量 (80?300 uL) 的 高 通 量 濃 縮 或 緩 沖 液 交 換 。系 統 可 設 計 為 包 含 各 種 分 子 質 量 篩 截（1 〇 ?100 k D a) 的膜，并具有高于9 0 % 的回收率。板的構造模式消除了橫向流和孔間混合，并包含有出口末端和防濺罩, 以確保清潔的濾液回收。 PaliCorporation 提供了 9 6 孔 或 384孔濾板形式的 T h e AcroPrep? 濾板 (Pall Corporation, M e r i d e n, C T )。

(5) 攪拌單元裝置將平板超濾膜盤放置于一個合適的支撐板上，并密封于圓柱形外殼的底部。根據設計，設備中的液體通過懸掛于頂部的一個磁力攪拌棒進行攪動，使用空氣作為壓力驅動液體進行超濾。 Millip0r e 公 司 和 Sterlitech 公司都提供了各種規格的設備 ，處 理 的 樣 品 量 為 3 ? 400 m L 。這 些 設 備 的 設 計 使 用 了 不 同 的 超 濾 膜 來 模 擬橫向流/切向流過濾。

盡管以上介紹的前 4 種設備可能是最易于操作的，并能對很小體積的樣本進行處理，然而它們缺少針對膜上的濃縮或濃差極化進行精確控制的設計。相比之下，由于具有攪拌功能，且具有可同時進行緩沖液交換和產品濃縮的能力, 攪拌單元設備具有改良的傳質功能和對濃縮的控制能力。使用超濾進行緩沖液交換的過程被稱為滲濾（ diafiltration)。 在滲濾過程中，用于交換的緩沖液在過濾的過程中加入到滯留物或進料中，當過量的液體濾過膜時，能滲過超濾膜的緩沖液成分從原料中被移除。相比于通過膜兩邊溶
質的濃度差而驅動緩沖液交換的透析法, 在超濾過程中，由于膜兩側的緩沖液的對流流動 ，其緩沖液交換進程更快。這有利于處理不穩定或需要立即進行緩沖液交換的蛋白質或生物制品。滲濾可以采用以下兩種模式中的一種來進行。在連續的滲濾中，洗滌 (交換) 緩沖液在過濾過程中被連續地加人，這一系統通常設計為在處理過程中原料的體積保持恒定。在不連續的滲濾過程中，原料的體積在經過一個常規的超濾后降低到一個預設的量。然后將洗滌緩沖液加入到原料槽中繼續過濾。這一過程可以重復直到得到想要的溶質濃度且體積減小到所需的量。

3.純化應用

超濾膜及超濾系統技術的最新進展將超濾的應用由濃縮和緩沖液置換擴展到其他更加復雜的生物分離領域。相 比 較 于 傳 統 的 結 合 脫 柱 層 析 ，這些新型的基于膜的「純化」應用已經被它們的低運行成本和易于使用的優點所推動。最近的研究表明，可以利用靜電相互作用來提高傳統的基于顆粒大小的、基于膜的處理方式的性能, 這種方法被稱為高性能切向流過濾 (Sakena and Z y d n e y ， 1994; van Reis et al. , 1997)。這些膜旨在通過利用分子和膜孔間的靜電相互作用，對那些大小相同但等電點不同的生物分子加以分離。此外，在膜色譜領域 (或親和膜色譜），使用具有較大孔隙范圍的膜 (微孔過濾膜） 比使用超濾膜具有明顯的優勢。膜吸附已被接受作為一種替代的方法用于最終的精制色譜步驟來去除痕量雜質 (G h o s h ， 2002)。有多種商業化的以陰離子或陽離子交換的形式起作用的吸附劑可從 Sartorius 公 司和 Pall 公司獲得，與基于凝膠顆粒的色譜不同，這些吸附劑的設計使之可以克服相關的擴散傳質限制。通常情況下，帶電的配體固定在膜孔中，對流流動使溶質分子極為接近配體，從而最大可能的減少了擴散限度。雖然膜吸附具有高通量的優點和實現高生產率的可能性，但這一技術的應用進展一直非常緩慢，因為膜色譜的結合能力比傳統的樹脂色譜要低，從而導致它在實際應用中受到限制。

五、冷 凍 干 燥

溶液中溶質的濃縮可以從熱力學上通過驅使溶劑變成氣態進人頂部空間 (蒸發) 或煮沸而實現。不幸的是，不穩定的溶質(如蛋白質分子)可以被用于除去溶劑所需的熱量快速降解。由于溶液的沸點是溶液的蒸氣壓等于大氣壓 (頂部空氣壓力） 時的溫度，因此，通過增加溶液的溫度或通過降低大氣壓力 (如采用真空) 都可以使溶劑沸騰。其中后者被稱為真空濃縮 ( v a c u u m concentration)。在冷凍干燥的過程中，樣品的溫度比溶液的凝固點要低 ，溶劑通過升華而被去除。冷凍和真空可同時進行，熱量和頂部的空氣此時被除去，從而對感興趣的產品進行濃縮。將要被冷凍干燥的液態蛋白質產品通常含有生物活性成分 、溶劑體系和幾種膨脹劑及穩定劑。膨脹劑為活性分子提供支撐結構，而穩定劑則在冷凍干燥之前和樣品重新組成之后的液態形式下，對目標蛋白質活性的維持發揮重要的作用 。冷凍干燥一般分為 3 個主要的步驟 （Costantino and Pikal， 2004;Jennings, 1999;Przic et al.， 2004)

（1） 冷凍冷凍速率會影響最終產品的質量。例如，慢速冷凍會導致大冰晶的形成,它會加快冷凍干燥的速率，但可能會使不穩定的蛋白質變性。相反 ，當樣品冷凍快速進行 ，會形成小的冰晶，它會使冷凍干燥速率降低，但卻能保護蛋白質的穩定性。

(2) 初 級 干 燥 在 初 級 干 燥 過 程 中 ，通過升華作用, 大于 8 0 % 的溶劑從固態直接變為氣態。殘留的溶劑以濕氣的形式仍然吸附在產品上。類似于冷凍速率，干燥速率會影響凍干「蛋糕」的結構和形態，所設計的速率要避免樣品融化。

(3) 二 次 干 燥 在二次干燥中，溶 劑殘留的吸附降低到足以抑制微生物生長或化學反應發生的潮濕水平，但同時仍保持了凍干產品的活性和完整性。產品的物理性質決定了二次干燥的可持續時間。例如，蛋白質通常需要殘留水分的存在以維持結構的完整性和生物活性。必要殘余水分的量因產品而異，必須憑經驗而定。

圖 9. 4 總結了冷凍干燥器的主要組成和操作過程。盡管冷