制樣的方法根據所選用電泳方法的性質而定。讀者可參考本卷其他章節中有關非變性凝膠電泳和等電聚焦電泳的討論。最常用的 SDS 凝膠電泳是蛋白質純度檢測的「第一線」(front-line) 方法。由于通常純度評價是非定量的，因此不需要關心諸如極端大小分子的非線性遷移、蛋白質修飾造成的遷移異常以及 SDS 結合不均勻等 Rhodes 等 (2009) 討論過的問題。另外，需要考慮樣品處理和制備過程中的一致性和均一性，以及分離過程中樣品所處的環境。例如，制備均一的蛋白質樣品時，未徹底還原二硫鍵將會使結果表現出異質性。同樣，凝膠交聯不均一導致的膠內遷移率差異，也會造成對結果的錯誤判斷，但是適當的重復和對照會使這種可能性降到最低。
通常，實驗者并不知道一個樣品中所有蛋白質組分的大小，因此很難預測膠的濃度，從而以最佳效果分離一組蛋白質組分。梯度膠 (gradientgel), 也稱為分級孔隙膠 (gelsofgradedporosity), 能夠覆蓋非常寬的分子質大小范圍。盡管梯度膠不可能產生最好的特定分離效果，但是它可以覆蓋最寬分子質量范圍，從而最大可能的鑒定某種雜質。分辨雜質的能力主要取決于所選擇的膠濃度梯度范圍。梯度的設計應該使目標蛋白質條帶處于中間的膠濃度。膠頂端丙烯酰胺的濃度 (低濃度) 應該足夠低，從而使大分子質量的雜質能夠進入到凝膠基質中。膠底部 (高濃度) 濃度應該足夠高，使小分子蛋白質能夠保持在凝膠基質中。通常預制梯度膠的最低濃度是 4% 丙烯酰胺，高濃度極限標準為 20%。如果這個范圍不合適, 可以制備低至 2%、高至 40% 濃度范圍的膠。分子質量大約 IMDa 的蛋白質應該能夠穿過 2% 的凝膠基質。通常大多數梯度膠的丙烯酰胺高濃度不超過 30%。即使在長時間電泳中也僅有非常少數的多肽能夠穿透 30% 凝膠。梯度膠的濃度范圍決定著膠的分辨率。因此，雖然 2%~30% 的梯度膠能夠檢測最寬范圍的分子大小，但是在分離分子質量幾乎相同的兩種蛋白質時，分辨效果卻不如 8%~16% 的梯度膠。
梯度的選擇很大程度上取決于研究者對整個待測系統的了解。例如，如果不存在特別小和特別大的分子，則最好選擇窄的濃度梯度范圍的膠或濃度恒定的膠。
如果需要特殊的梯度，制作梯度膠的過程與制作常規聚丙烯酰胺凝膠的過程差距甚微，與用于沉降的蔗糖梯度制作過程也很類似。與常規聚丙烯酰胺凝膠制備過程相比，梯度膠制備難點在于兩塊不同丙烯酰胺濃度的膠必須平行制作。而比蔗糖梯度制作麻煩是因為梯度膠有丙烯酰胺聚合的時間限制。目前已有一些商業化梯度形成儀，而具體技術方法上的不同可以通過査找相關文獻來了解。
梯度膠的電泳過程類似于常規電泳法 [Rhodes 等 (2009) 及本書中其他部分介紹]。
膠分析所用的染色手段由預期污染物決定。可以通過將其他方法與電泳法結合來完成二維凝膠電泳分析，由此增強電泳方法的潛在靈敏度及其獲得的信息。一般第二維是梯度 SDS~PAGE, 而第一維可能是非變性凝膠電泳、等電聚焦 (isoelectricfocusinggel) 或者不同條件下的變性電泳 (如沒有二硫鍵還原）。
等電聚焦也能檢測寬泛范圍的污染物，而且可以與電泳方法聯用。商業化預制凝膠在同一塊膠上的等電點覆蓋范圍可達 3~10。等電聚焦步驟見本書其他章節，這里不復述。等電點覆蓋范圍廣是一個相當大的優勢，而對于等電點相差細微的蛋白質, 可以通過減小等電點范圍 (如 4~5、5~8) 來提高區分的靈敏度。除了能夠分離等電點不同的分子，等電聚焦法還可通過其他性質來分辨污染物。
鑒于凝膠電泳法的簡單和低成本，通常將其作為純度評價的首選方法。然而，在采用該方法時也需要謹記一些潛在的問題。對于變性凝膠, 可能出現假陰性和假陽性現象。
如果發生雜質共遷移 (comigrating) 或者雜質無法進入凝膠的情況，則會出現假陰性。因此應該將整塊膠，包括濃縮膠和分離膠都染色，并且需要檢驗蛋白質染料是否合適。例如，樣品條帶若殘留于上樣孔或處于濃縮膠和分離膠之間，表明存在高分子質量的雜質，或者雜質溶解度有限。同時，常用的蛋白質染色劑（proteinstain), 如考馬斯亮藍與纖維狀蛋白質及糖蛋白的結合力較弱，如此將低估此類雜質的含量。而假陽性的產生, 可能是由于樣品制備時發生共價修飾，或者膠不均一和氧化劑殘留。非變性凝膠中也會出現類似問題，此外目標蛋白質或雜質凈電荷的不確定性也會導致意外發生（Rhodesetal.,2009)。如果雜質的靜電荷為零或者與目標蛋白質相反，雜質將不會出現在膠上, 除非使用中心上樣水平凝膠 (center-loadedhorizontalgel)，也可以盡可能加寬非變性凝膠電泳的 pH 范圍解決該問題。
等電聚焦相關偽跡 (artifact) 的產生主要是由于用來生成 PH 梯度的多聚兩性電解質顆粒與蛋白質相互干擾，造成條帶 (一般是彌散的) 在膠上的結果與目標蛋白質的等電點無關。檢測這種可能性的一種方法是從中選擇一條條帶分離出蛋白質，并且用相同的等電聚焦過程分析分離出的蛋白質。如果原結果分布反映了樣品中的實際異質性，則分離出的蛋白質只能形成與原始同樣的點。然而，如果原始條帶是假象，那么分離出的蛋白質將重現原來的分布模式，包括虛假條帶。
凝膠過濾色譜法是檢測與目的分子大小不同的雜質的最簡單方法之一。這一方法無破壞性并且非常快速。因為這是一種「區帶方法」(zonalmethod), 樣品通過凝膠柱時會被稀釋, 因此需設置恰好高于最小檢測限度的起始濃度。而確切使用量則取決于用本方法檢測雜質時的靈敏度。
本卷介紹的測定蛋白質大小的樣品和凝膠柱制備的方法, 在本章中將用來評價雜質 (Rhodesetal.，2009)。兩種應用唯一的區別在于，后者所用檢測方法不僅需要對目標蛋白質的靈敏度高，對雜質同樣要求高靈敏度。盡管評價樣品純度時并不需要校準凝膠柱，但這樣做有兩個好處。首先，實驗者使用校準凝膠柱可以獲得有關雜質大小的信息；其次，使用校準凝膠柱可以在檢測雜質存在的同時測定分子質量。為此, 通常需要進行兩個測定: 第一個是蛋白質的非特異測定 (如測 280nm、220mn 吸光度）；第二個是特異檢測 (酶活檢測、免疫學檢測、質譜、多角度光散射檢測等），用來確認所分析蛋白質的身份。
雜質在色譜圖中可能表現為獨立的峰，也可能使洗脫譜變寬 [如肩臺（shoulder)]。原則上，洗脫譜應該接近高斯分布 (邊緣有微小的偏移，見問題和局限）。如果分析蛋白質峰有強烈偏移、峰有肩臺，或者特異和非特異測定結果不相符，說明樣品中存在雜質。
凝膠過濾色譜法檢測分子大小的靈敏度低于電泳法。一般來說, 凝膠過濾實驗需要的材料量大于電泳法所需。由于凝膠過濾色譜通常在天然狀態下進行，因此結果可以反映樣品異質性。如果蛋白質以一系列穩定的寡聚物形式存在 (如脂肪酸合酶），在凝膠過濾色譜將表現出異質性。同樣，發生快速、可逆的自聯作用的蛋白質會表現出異常的濃度依賴性洗脫譜。這些情況下，可通過進一步測定來區分異質性和分子偶聯。例如，從不對稱峰和加寬峰中選取不同部分來重復膠過濾色譜法，或采用本章和本卷介紹的其他方法測定選取的部分。這些方法都可以提供目的分子的有用信息。
另一個應用廣泛的色譜分離方法就是反相高效液相色譜法 (reversedphaseHPLQ。
這種方法用諸如改性硅介質等非極性基質作為固定相，進行極性遞減的梯度洗脫。例如，在含 0.05% 三氟乙酸 (TFA) 的緩沖液中，蛋白質將通過疏水性氨基酸與 C-18 改性硅介質結合，從而結合于固定相，再從 0.05% 三氟乙酸逐漸提高到一定量合適的有機溶劑洗脫蛋白質, 如乙腈、甲醇或乙醇等，通常三氟乙酸含量保持一致。流動相中的有機溶劑減小了蛋白質與固定相的親和力，從而將蛋白質洗脫下來。與其他梯度洗脫方法一樣，緩慢的梯度洗脫可以獲得最佳分辨率，但是首次實驗時最好先進行快速梯度洗脫，如此可以得到主要分析物的洗脫最適溶劑條件，并可以根據與固定相親和力不同來篩選可能的雜質。
蛋白質的檢測通常是基于 215~220nm 處的紫外線吸光度來檢測肽段，而不是采用 280nm 檢測的芳香族氨基酸方法。暫且不論準備時間，梯度洗脫可在 Ih 內完成，大部分優化后的洗脫步驟將在 15~20 min 內完成。
由于該方法簡單且快速，具備現成的合適設備，能夠靈活應用多種不同特性來分離親和蛋白質，因此已普遍應用于蛋白質樣品的純度篩選檢測。如有必要，可采用多種不同的流動相使樣品可以在不同梯度和條件下得到分離，來確定主要分析物的純度。該方法還可以與其他方法聯用 [如質譜法 (見下文)] 來確定蛋白質身份并獲得可能存在雜質的信息。值得注意的是，由于有機溶劑的存在，洗脫下來的蛋白質可以預見到有一定程度的變性，不一定能夠保持天然構象。使用 C-4 或 C-8 固定相能夠將變性可能性降低到最小，這是因為它們與蛋白質有較弱的親和力，較低濃度的有機流動相就可用來洗脫。許多針對特定蛋白質的操作方案已經發表,HPLC 設備制造商也提供了許多產品信息。
沉降速度法 (sedimentationvelocitymethod) 能夠簡單快速且非破壞性的來評價一個蛋白質的純度，這種方法對分子質量和分子大小的比值非常靈敏。關于沉降速率測定法在 Rhodes 等 (2009) 的文獻中有簡要介紹。一般來說，當使用沉降速率測定法來檢測蛋白質純度時，實驗者能夠找到的沉降組分不止一種。該方法的優點在于測定的材料范圍非常廣 (尤其是使用折射式光學系統時），但最大的局限在于，它對分子質量相差小的樣品的靈敏度不如電泳技術，甚至區帶沉降 (bandsedimentation) 也不可避免這種問題。
本卷中 (Rhodesetal.，2009;Coleetal.，2008) 詳細介紹了除區帶沉降法之外的一些方法, 如樣品制備、選擇合適的光學系統及實驗結果的分析。如何準備離心來實施速率區帶沉降實驗 (rate-zonalsedimentation) 可參考設備說明書。利用超速分析離心機來實施區帶沉降法的細節可以參考 Eason(1984) 或 Ralston(1993) 的文獻, 數據的分析類似于凝膠過濾色譜法。
差示沉降系數分布（differentialsedimentationcoefficientdistribution)，g(s)(Coleetal.,2008) 分析，是非常有效的雜質檢測方法。由于這種方法是模型非依賴性的，因此多組分的存在形式將會是不同夂沉降系數) 值的峰，或是代表主要分析物的峰加寬。另外，與凝膠過濾層析法相同，盡管蛋白質純度很髙，自身結合蛋白質的沉降行為表現為峰加寬或多峰，使用平衡超離心或其他方法可以幫助解決這個問題。
由于質譜法可以直接測定一個樣品中共價質量的分布，因此這種方法能夠非常簡便、靈敏地測定雜質。質譜不僅可以檢測雜質的存在，還可以描述雜質的質量特征，因此質譜法常被用于鑒定雜質的來源。除了能夠直接測定蛋白質分子質量大小，通過串聯質譜 (MS,’MS 或 MS2) 法，如碰撞誘導解離（collisioninduceddissociation，CID)、電子轉移解離（electrontransferdissociation，ETD)、電子捕獲解離（electroncapturedissociation，ECD) 及紅外多光子解離（infraredmultiphotondissociation，IRMPD) 等，還可以鑒定共價改性修飾特征和位點。其中，CBD 和 IRMPD 可以測定相當小的蛋白質 (<15kDa)，而 ETD 和 ECD 可用于分子質量較大的蛋白質 (約 50kDa)。除此之外，共價修飾鍵改性及其位點的測定可以用任意一種常用的蛋白質水解法，如胰酶或溴化氰（CNBr)(Link，2009)。在使用飛行時間質譜 (time-of-flightmassanalyzer) 分析前,CID 可通過四級桿碰撞反應池 (quadrupolecollisioncell) 實現（Q-toFconfiguration)。ETD、ECD 和 IRMPD 常用于離子講分析儀（ion-trapanalyzer)，如線性離子講（lineariontrap)、軌道講（orbitrap)、軌道講及傅里葉變換離子回旋共振質譜儀（fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometer)Q 與光散射法類似，將質譜法與其他方法聯用 (如凝膠分離色譜) 可以達到最佳的效果。
由于雜質可能與主要分析物有相同的質荷比，因此將質譜法與其他分離方法聯用可以增加樣品純度測定的準確度。例如, 如果在凝膠排阻層析的洗脫峰中出現不對稱峰，質量檢測將幫助區分其是由大小不同的雜質所導致，還是由于自身相關的分子所導致。不同于光散射法基于回轉半徑 rg(theradiusofgyration) 測量而計算質量，質譜法對蛋白質的質量測量更加準確。
如 Rhod=等 (2009) 所述，目前一些儀器能夠進行靜態或動態光散射來測定單個樣品，或者監控高效液相色譜和場級 (FFF) 分離過程。通過對分子大小和表觀分子質量的連續測定，增強了鑒定洗脫蛋白質的能力，能夠區別待分析物、待分析物多種形式的聚集體或雜質。光散射法非常簡單且無破壞性，并且目前的儀器能夠提供一個洗脫時間函數的分子質量圖。這樣，如果一個紫外線檢測峰不對稱，多角度光散射 (multipleanglelightscattering，MALS); 也稱多角度激光散射 (multipleanglelaserlightscattering,MALLS) 分析結果則可能表現為峰的主要部分的表觀分子質量為 mol/L，而邊緣為 2mol/L, 這說明可能存在二聚體。需要注意的是，倍數分子質量的存在并不證明一定存在自身結合，還需采用不同的方法驗證該結果。盡管 MALS 結果不如質譜準確，但是所需的設備更便宜且操作簡單。