2）在4℃條件下以20000g的離心力冷凍離心60分鐘 （離心力務必達到或大于20000g）。
3）移取上清溶液。若上清樣品不立即使用，則須儲存于-80℃（最佳條件）或-20℃的無霜冰箱中以防止蛋白質的降解。
2、用初始緩沖液（Start buffer）交換處理細胞裂解液
1）在上述細胞裂解液中，加入初始緩沖液至最后體積為2.5mL，充分混合。
2）用約25mL初始緩沖液平衡PD-10柱（編號：17-0851-01）。
3）加入步驟第1）所獲得的2.5mL樣品到PD-10柱, 丟棄洗脫液。
4）用初始緩沖液洗脫, 從PD-10柱中洗脫蛋白質,收集前3.5mL部分。
5）所獲得的3.5mL樣品即可用于HPCF 1D柱的進樣分離分析。
* 為檢驗所獲得樣品的優劣，可取50uL上述已經交換過的樣品進樣到HPRP
2D柱，觀察所有蛋白的反相洗脫色圖譜。在這一步,如果樣品制備有一些問題, 在分析色譜圖后將會鑒別出來。注意: 根據化合物和蛋白的量預測樣品,
在這時應該得到一張“豪豬”狀的色譜圖(a very "spikey or porcupine" liking
chromatogram)，使你分析的樣品有意義,如果沒有這樣的蛋白圖譜, 請停止進行色譜聚焦分離分析，繼續摸索樣品的制備方法。
四、膜蛋白裂解方法步驟
1、膜蛋白裂解緩沖液的組份及其終濃度
尿素5M
硫脲2M
甘油10%
Tris-HCl50mM (pH 7.8-8.2, 10-25℃)
n-辛基葡糖苷2.0%
SB3-10(N-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate) 2.5%(w/v)
TCEP (Tris (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) 5 mM
蛋白酶抑制劑 1.0mM
2、10%甘油溶液（100mL）的配制
1）量取1mL甘油到100mL的量筒；
2）加蒸餾水至指定刻度（100mL）。
3、31.45mM蛋白酶抑制劑溶液（母液）（10mL）的配置
1） 在P/N P2714蛋白酶抑制劑中加入10.0 mL的水，混勻。
2） 分裝到2mL的小瓶中，放置在-20℃保存備用。
4、裂解緩沖液儲備液（50mL）的配制
1）取10% 的甘油溶液20 mL 放在100 mL的燒杯中；
2）加入Tris0.304 g (Fisher, Part Number: BP154-1),攪拌至完全溶解（50Mm）;
3）慢慢加入硫脲7.61 g (Sigma, Part Number: T7875, FW 76.12), 攪拌至完全溶解;
4）慢慢加入15.02 g尿素(Sigma, Part Number: U0631, FW 60.06) , 攪拌至完全溶解;
5）慢慢加入1.0 g n-辛基葡糖苷(Sigma, Part Number: O8001, FW 292.4), 攪拌至完全溶解;
6）慢慢加入1.25 g SB3-10 (Sigma Part number: D4266, FW 307.5) , 攪拌至完全溶解;
7）慢慢加入0.072 g TCEP (Sigma, Part Number: C4706, FW 286.7), 攪拌至完全溶解;
8）加入31.45mM蛋白酶抑制劑溶液1.6mL, 攪拌至完全溶解;
9）轉移到50mL的量杯中, 加10%甘油溶液至50mL容量;
10）分裝到2.0 mL的小瓶中, 在-20℃中保存備用。
5、膜蛋白裂解方法步驟
1）取以上的裂解緩沖液2.0 mL懸浮細胞膜樣品, 充分振蕩混合。
2）在4條件下離心力20000g下冷凍離心60分鐘（離心力務必大于或
等于20000g）。
3）移取上清液。若上清液樣品不立即使用，則須儲存于-80℃（最佳條件）或-20℃的無霜冰箱中以防止蛋白質的降解。
6、用初始緩沖液（Start buffer）交換處理細胞裂解液
1）在上述細胞裂解液中，加入初始緩沖液至最后體積為2.5mL，充分混合。
2）用約25mL初始緩沖液平衡PD-10柱（編號：17-0851-01）。
3）加入步驟第1）所獲得的2.5mL樣品到PD-10柱, 丟棄洗脫液。
4）用初始緩沖液洗脫, 從PD-10柱中洗脫蛋白質,收集前3.5mL部分。
5）所獲得的3.5mL樣品即可用于HPCF 1D柱的進樣分離分析階段。
*為檢驗所獲得樣品的優劣，可取50uL上述已經交換過的樣品進樣到HPRP 2D柱，觀察所有蛋白的反相分離圖譜。在這一步,如果樣品制備有一些問題, 在分析譜圖后將會鑒別出來。注意:根據化合物和蛋白的量預測樣品,在這時應該得到一張“豪豬”狀的色譜圖(a very "spikey or porcupine" liking chromatogram)，使你分析的樣品有意義, 如果沒有得到這樣的蛋白圖譜,請停止進行色譜聚焦分離分析, 繼續摸索樣品制備步驟和方法。