蛋白質N磷酸化修飾富集方法進展

　　蛋白質N-磷酸化修飾富集方法進展

　　江波1, 高博2, 魏淑嫻2, 梁振1, 張麗華1,*, 張玉奎1

　　1.中國科學院大連化學物理研究所,醫學蛋白質組全國重點實驗室,國家色譜研究中心, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023

　　2.中國石油大學(華東)化學化工學院,山東 青島 266580

　　蛋白質磷酸化作為一種最普遍和最重要的翻譯后修飾調控著幾乎所有的生命過程。隨著高效富集方法和生物質譜技術的快速發展,低豐度的蛋白質O-磷酸化修飾獲得了規模化鑒定,從而使其生物學功能得到較為透徹的研究。而發生在組氨酸、賴氨酸和精氨酸側鏈氨基的N-磷酸化修飾,由于P-N鍵化學穩定性差,導致其在酸和熱條件下不穩定。而目前依賴酸性條件的O-磷酸化富集方法難以適用N-磷酸化富集,導致蛋白質N-磷酸化生物功能研究嚴重滯后。因此,迫切需要發展針對蛋白質N-磷酸化的高效富集方法。本文首先介紹了蛋白質N-磷酸化的結構特征和已報道的生物學功能,重點綜述并分析了近20年來蛋白質N-磷酸化修飾富集方法,并對每一種富集方法的優缺點進行了評述,最后對潛在的富集方法進行了展望。

　　蛋白質N-磷酸化的重要生物功能

　　1.1 pHis的生物功能

　　1.2 pArg的生物功能

　　蛋白質N-磷酸化修飾富集方法

　　近20年來蛋白質O-磷酸化修飾富集方法得到了長足進步,超過數萬個O-磷酸化位點被規模化鑒定出來,規模化鑒定進一步促進了O-磷酸化生物功能的研究,如針對酪氨酸磷酸化的激酶抑制劑被開發用于腫瘤治療。然而,N-磷酸化功能研究還處于起步階段,主要原因是N-磷酸化修飾的化學性質不穩定,難以實現規模化鑒定。N-磷酸化修飾中P-N酰胺鍵水解吉布斯自由能較高,在酸和熱條件下不穩定。然而,目前針對O-磷酸化的富集方法需要強酸富集條件,并不適用于N-磷酸化富集。因此,亟需發展針對N-磷酸化修飾的富集方法,以實現其規模化鑒定。本文總結了近20年來N-磷酸化修飾富集方法進展,以供讀者在研究其生物學功能時使用。

　　2.1 親和富集法

　　2.2 固定化金屬離子色譜(IMAC)材料

　　2.3 Phos-Tag功能化材料

　　2.4 金屬氧化物色譜(MOAC)

　　2.5 化學標記法

　　2.6 蛋白質N-磷酸化富集存在的問題

　　結論與展望

　　本文總結了近20年來蛋白質N-磷酸化修飾富集方法的研究進展,親和抗體、IMAC、Phos-Tag功能化材料、MOAC、化學標記法已經被開發用于N-磷酸化修飾的富集研究。通過這些方法已經有超過數千個N-磷酸化位點被鑒定到,這些方法可用于原核生物和哺乳動物N-磷酸化位點的發現。利用已經發現的位點,研究人員建立了N-磷酸化位點數據庫。這些研究極大地促進了N-磷酸化的研究。盡管N-磷酸化富集方法研究取得了一定進展,但相對于O-磷酸化富集方法,N-磷酸化富集方法發展依舊滯后。隨著生物技術、化學合成和材料科學的發展,一些新富集策略可嘗試用于N-磷酸化修飾的富集研究。

　　智能聚合物基材料通過外部物理、化學或生物刺激可逆地改變其結構和功能,可實現對磷酸化肽高度可控的吸附和脫附,實現高選擇性富集。一方面,智能聚合物基材料的響應變化包括材料疏水性的增加或減少、形狀和形貌的改變、表面電荷的重新分布以及親和配體的暴露或隱藏等特性。這些特性使得磷酸化肽段和智能聚合物基材料之間的親和力可以通過簡單改變外部條件(如溫度、pH值、溶劑極性和生物分子等)而改變,進而實現更可控和更智能的精細調節。另一方面,智能聚合物基材料為集成功能模塊提供了便捷的可擴展平臺,例如特定的識別組件,顯著提高磷酸化肽段的分離選擇性。如楊海波等通過結合金屬配位自組裝和后修飾的聚合反應,制備了一種新型的以有機鉑金屬大環為核心骨架的超分子聚合物。該超分子聚合物同時包含氫鍵和靜電相互作用等多種磷酸根識別位點,因此對磷酸化肽的結合具有較高的選擇性,金屬環骨架上的多個正電荷使聚合物層與層之間通過靜電排斥彼此分離,從而形成穩定且易于轉移的二維超分子聚合物。因此,有利于增加磷酸化肽與聚合物材料間的接觸面積,從而實現在水溶液中快速高效地捕獲磷酸化肽。通過簡單的水洗和離心即可方便地除去非磷酸化肽。同時,得益于聚合物核心骨架獨特的刺激響應性能以及與磷酸化肽在響應前后結合能力的巨大差異,該智能超分子聚合物可以在中性條件下實現對磷酸化肽有效的洗脫與釋放。研究結果展現了對N-磷酸化肽段高效的富集潛力。

　　基于色譜的富集方法是實現N-磷酸化修飾高效富集的重要手段,Eyers等利用強陰離子色譜作為富集手段,通過調節富集pH值,在中性條件下實現了N-磷酸化肽段的高效富集。類似的原理,發展親水相互作用色譜,利用親水固定相和N-磷酸化肽段之間親水作用,也可在中性條件下實現N-磷酸化肽段的有效富集。另外可以制備分子印跡聚合物,雖然難以實現N-磷酸化肽段/蛋白質規模化富集,但是適用于單個N-磷酸化肽段/蛋白質的富集,如制備NDPK-B的分子印跡聚合物,利用化學性質和結構匹配實現NDPK-B的選擇性富集。