| 實驗步驟 |
鑄分離膠（下層膠)
裝置的清洗
為使角蛋白的污染減至最少，將玻板、梳子和隔條浸泡在含強堿性去垢劑〔2%RBS
35 液（Pierce Chemical Co.)〕提濃物的水溶液（每 1000 ml 水加 20 ml
提濃物中。可將去垢劑溶液置于一帶蓋的盆中，盆中放一支架，將玻板懸置于支架上至少保持 10
min(或過夜)。此外，努力保持凝膠材料和溶液盡可能是無塵的。有時要用緩沖液對吸管進行預沖洗，以除去可能沉積于吸管內的灰塵顆粒。操作時要一直戴手套并經常變動它們的位置。用不會留下顆粒的紙巾（如
Kimwipes 紙巾）擦干玻板，或用甲醇或丙酮洗滌玻板并在通風櫥中風干。
分離膠的混合
在對待測蛋白質的大小所作最佳估計的基礎上，選擇合適的丙烯酰胺濃度。下表概括了制備不同百分比的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺混合物所需成分的用量。表的上方給出了最小待測蛋白質的分子量范圍。
分離膠的灌注
1) 將丙烯酰胺/雙丙烯酰胺、H20、4x 分離膠緩沖液混合于帶側臂口的小號 (25 ml）愛倫美氏燒瓶。
2) 用塞塞住瓶口，混合物真空脫氣 10 min。
3) 加 APS, 溫和但徹底混勻。盡量避免產生氣泡。
4) 加 TEMED。溫和但迅速混勻。
5) 用經水預洗凈的巴氏吸管灌注膠液，直至液面高度離玻板頂部約 1 cm 處。
6) 用預洗凈的巴氏吸管在膠液上面均勻布一層異丁醇（2-甲基-1-丙醇）。異丁醇層應高約 2 mm。
7) 分離膠至少聚合 1 h。
鑄壓縮膠（上層膠）
壓縮膠的混合
壓縮膠的灌注
1) 將丙烯酰胺/雙丙烯酰胺、H2O、4x 分離膠緩沖液混合于帶側臂口的小號(25 ml) 愛倫美氏燒瓶。
2) 用塞塞住瓶口，混合物真空下脫氣 10 min。
3) 分離膠聚合后，傾出上層液體異丁醇和未聚合的丙烯酰胺。
4）用蒸餾、去離子水洗滌膠的上部。
5) 用壓縮膠液洗滌膠的上部。
6) 將梳子插入玻板之間。
7) 加 APS, 溫和但徹底混勻。努力避免產生氣泡。
8) 加 TEMED。溫和但迅速混勻。
9) 用預先經水洗凈的巴氏吸管灌注壓縮膠液。
壓縮膠應在 10 mm 內聚合。在 2 h 內使用。
電泳
樣品的制備
1) 將沉淀或凍干的各樣品分別置于 1.5-ml 具蓋聚丙烯離心管中，各加入 5~20ul 含 2-巰基乙醇的 1X 樣品緩沖液（配方見 p.257)。短暫震蕩混合后立即置于沸水浴中支架上 5 min。
2）樣品冷卻至室溫，微型離心機短暫離心（~10s)。
加樣
1）小心地取出梳子，將聚合的凝膠安置于電泳槽中。上、下槽中加入電泳緩沖液 (1X)(配方見 PP.256~257)，確保每個樣品孔中都充滿緩沖液。小心地去除樣品孔中的所有氣泡或額外的聚丙烯酰胺碎片。
2) 每個樣品按合適的體積加樣，對于 0.15 cm 厚的膠，通常最多加 15ul 樣品因樣品含 10% 甘油，樣品會通過樣品孔中的緩沖液而沉入孔底。
3) 當心樣品不要溢出至樣品孔間的分隔部而混合。用自動移液器上樣應用出口極細的吸頭，每個樣品換一個吸頭。
電泳
1) 將電極導線接至電源，黑的接于負極，紅的接于正極 pH8.3 時，與 SDS 結合的蛋白質荷負電，它們將向正極遷移。
2) 壓縮膠部分每塊膠以 8mA 電流（恒流) 電泳。若兩塊膠在一個電泳槽內同時進行電泳，則以 16mA 電流進行電泳。在壓縮膠/分離膠界面處，蛋白質樣品將壓縮成一窄帶。
3) 當溴酚藍進入分離膠時，每塊膠的電流增至 18mA。
4) 溴酚藍達到膠的底部時，即關掉電源，停止電泳。不應讓溴酚藍跑出底部。
溶液和緩沖液的配制
丙烯酰胺/雙丙烯酰胺儲液（30:0.8）(1000 ml)
30%(w/v) 丙烯酰胺 300 g
0.8%(w/v) 雙丙烯酰胺 8 g
加去離子蒸餾水，至終體積 1000 ml。經 0.22-um 膜過濾。存于 4°C 暗處。
分離膠緩沖液（4x)
1.5mol/LTris-HCl(pH8.0)
0.4%(w/v)SDS
加去離子蒸餾水, 至所需終體積。室溫下用 HCl 調 pH 至 8.8。經 0.22-um 膜過濾。存于 4°C
壓縮膠緩沖液 (4X)
0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)
0.4%(w/v)SDS
加去離子蒸餾水, 至所需終體積。室溫下用 HC1 調 pH 至 6.8。經 0.22-um 膜過濾。存于 4°C。
電極緩沖液 (4X)
0.1mol/LTris
0.768mol/L 甘氨酸
加去離子蒸餾水，至所需終體積。不必調 pH。此比例時 Tris 堿-甘氨酸的 pH 應為 8.3。室溫下存于大容器（酸壇）中。
SDS(10%;w/v)
(100 ml)
取 10 gSDS 溶于去離子蒸餾水中，至終體積 100 ml。室溫下存于潔凈瓶中。
電泳緩沖液（1X)
1/4 體積的 4x 電極緩沖液與 3/4 體積的去離子蒸餾水混合。然后加 1/100 體積的 10%SDS 至終濃度 0.1%(w/v)SDS。實例如下：
樣品緩沖液 (2X) 儲液
0.25mol/LTris-HCl(pH6.8)
4%(w/v)SDS
20%（v/v) 甘油
痕量溴酚藍
配制此緩沖液時，應極小心，戴手套，并避免角蛋白（皮膚上即存在此蛋白) 對緩沖液的污染。
加 H2O 至 100 ml 終體積。此緩沖液可室溫下保存或等分凍干保存，但用前必須溫熱以確保 SDS 于溶液中。應保證反復使用此溶液的同一儲液而不被污染。等分保存將有助于避免這個問題。
含 2-巰基乙醇的樣品緩沖液（1X)
用前配制樣品緩沖液的工作液，稀釋 2X 樣品緩沖液儲液（見上，加入 2-巰基乙醇至終濃度為 5%(v/v)。例如：
2x 樣品緩沖液儲液 100ul
H20 90ul
2-巰基乙醇 10ul/200ul
過硫酸銨 (APS)(10%;W/V）
取 3 g 過硫酸銨，溶于去離子蒸餾水，至終體積為 30 ml。此溶液 4°C 下在短暫的數日內是穩定的，但建議，對每一組新膠均應新鮮配制。
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