蛋白酶的測定實驗

實驗方法原理

血紅蛋白不是很貴，被用來做這個實驗。由于處于天然結構的蛋白質通常可以抵制蛋白酶的攻擊，因此首先用尿素使血紅蛋白失活。分離非水解蛋白質后，利用 Folin-Ciocaheau 試劑的上清液測量消化產物。這種試劑優先識別色氨酸和酪氨酸，但是也可以識別半胱氨酸和組氨酸。'

實驗溫度取決于酶的專一性，為了穩定酶的活性，溫度可從室溫（25℃）變化到 50℃。

實驗材料 酶樣品

試劑、試劑盒 KH2PO4三氯乙酸Folin-Ciocaheau 苯酚試劑HClL-酪氨酸血紅蛋白底物

儀器、耗材 分光光度計

實驗步驟

實驗所需「試劑」具體見「其他」

1. 樣品液及空白對照的處理：

2. 校準曲線

準備 0～250 nmol L-酪氨酸的校準曲線。用 0.2 mol/L HCl 補充 0.2 mol/L L-酪氨酸（1 ul～1 nmol）的遞增量（約 12 種不同的樣品）直到 0.5 ml，并向每個樣品中加入 1 ml 0.5 mol/L NaOH 和 0.250 ml Folin-Ciocalteau 苯酚試劑（1：2 稀釋）。測量 750 nm 處對于空白對照（無酪氨酸）的吸收值變化，得到關于酪氨酸濃度增加與吸收值增加的線性曲線，直線的斜率＝吸收值/nmol Tyr。

3. 計算

由于很難測定從血紅素得到的摩爾產物，因此定義特別的 Anson 單位如下：1 AU 指在實驗條件下，1 min 產生相當于千分之一的酪氨酸（1 nmol 酪氨酸約 1AU）所產生的著色強度的酶量。

校準曲線斜率除以 750 nm 處的吸收值等于得到產物量，與 nmol Tyr成正比。要得到 uAU，這個值必須被培養時間除（min）并且乘以因子 3，這是因為只有總實驗量 1.5 ml 中的 0.5 ml 被用來顯色反應，并且這也是可能的稀釋因子。

實驗中的酶的活力：

對于整個酶溶液，得到的這個值必須乘以整個酶溶液的量，并被實驗用的酶量和轉化 AU 的因子除。

總的酶活性：

注意事項

其他

試劑：

1 mol/L NaOH（Mr＝40.0；4 g NaOH 溶于 100 ml H2O，儲存于 PE 管中）

0.5 mol/L NaOH（1：1 的 1 mol/L NaOH 和 H2O）

1 mol/L KH2PO4（Mr＝136.1；13.61 g 溶于 100 ml H2O 中）

0.3 mol/L 三氯乙酸（Mr＝163.4；4.9 g 溶于 H2O 中）

Folin-Ciocaheau 苯酚試劑（可購買到，儲存于 4℃；使用前用兩倍的水稀釋）

0.2 mol/L HCl［用H2O 將 3.31 ml HCl（37％）200 ml］

1 mmol/L L-酪氨酸（Mr＝181；18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl）

血紅蛋白底物：用 100 ml 的燒杯盛入 10 ml 的水，必須水浴，使溫度保持在 25℃。以下的組分，一邊攪拌一邊逐一加入 11.54 g 尿素、2.4 g 1 mol/L NaOH、0.635 g 冷凍的血紅素

攪拌 45 min 后，3.156 g 1 mol/L KH2PO4 溶解。加入水，使總重 32.6 g，并用 1 mol/L HCl 調 pH 至 7.5。溶液應該在低溫（5℃）儲存，并在 14 天內使用。對于每一種新制備的血紅素底物，使用不同的標準曲線。