蛋白鑒定方法之質譜相關技術

　　質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門。 用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，1）樣品入機的離子源，2）測量被介入離子的分子量的裝置。 首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（MALDI-TOF）為一脈沖式的離子化技術。 它從固相標本中產生離子，并在飛行管中測其分子量。 其次是電噴霧質譜（ESI-MS），是一連續離子化的方法，從液相中產生離子，聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量。 近年來，質譜的裝置和技術有了長足的進展。

　　在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器（ion reflectron）和延遲提取（delayed ion extraction），可達相當精確的分子量。 在ESI-MS中，納米級電霧源（nano-electrospray source）的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能。

　　將反相液相色譜和串聯質譜（tandem MS）聯用，可在數十個picomole的水平檢測；若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小于femtomole的水平檢測。 甚至可在attomole水平進行。 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用鑒定蛋白質。 下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質。

　　(1)肽質指紋術（peptide mass fingerprint， PMF）

　　由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量（MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS），這一技術能夠完成的肽質量可精確到0。1個分子量單位。 所有的肽質量最后與數據庫中理論肽質量相配比（理論肽是由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產生的）。 配比的結果是按照數據庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，“冠軍”肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。

　　(2)肽片段（peptide fragment）的部分測序

　　肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質。 為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段。 用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。 另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段。 化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在質譜儀內應用源后衰變（post-source decay， PSD）和碰撞誘導解離（collision-induced dissociation， CID），目的是產生包含有僅異于一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜。 因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息。 首先進行肽質指紋鑒定。 之后，一個有意義的肽片段在質譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應器的過程中降解為“子離子”。 在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。 但經常產生不完全的片段。 現在用肽片段來測序的方法始于70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成。 在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量。 與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量。 由此，序列可被推測。 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標簽”。 這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N -C端的距離將足以鑒定一個蛋白質。