1.取15ml研磨器,加入5ml血塊,4-5ml溶血試劑,研磨至無凝塊存在。轉移 到50ml離心管中,2500rpm,10min。
2.去上清,假溶血試劑清洗一遍,2500rpm,10min,至無紅色存在。
3.去上清,加1ml細胞裂解液,轉移到離心管,加20mg/ml蛋白酶K1oml,56度3小時.
4.每管加1ml平衡酚,混勻,6000rpm,10min.
5.重復步驟4.
6.取上清于2mlEP管,加等體積氯仿/異丙醇,混勻,6000rpm,10min.
7.取上清于另一2mlEP管,加NaAc,混勻,加等體積的異丙醇,混勻,可見白色沉淀,10000rpm,5min.
8.去上清,加0.3ml無水乙醇,10000rpm,5min,去酒精,風干。
9.加TE,水浴至DNA溶解,測DNA濃度。
注意事項:
要看一下酚的顏色,一般為黃色,如果變成粉紅色,說明被氧化,不能再用。
酚有強腐蝕性,易引起燒傷,一旦皮膚沾染上,應用清水沖洗,用肥皂或稀釋的蘇打水洗滌,切記不用酒精擦洗。
溶血試劑,細胞裂解液,TE需要高溫高壓消毒。
核酸因含有共軛的苯環而吸收紫外光,DNA和RNA的最大紫外光吸收波長為260nm。
260nm光吸收值為1時(A260=1),dsDNA的質量濃度相當于50ug/ml,則dsDNA的濃度為: A260 值× 50ug/ml ×稀釋倍數
純度: A260 /A280表示,如果純的dsDNA的值約為1.8,如果大于1.8,則說明有RNA的污染,如果小于1.8,則說明樣品中有蛋白質或飽和酚的污染。
注意點:提取的DNA應該完全溶解后再測其濃度,而且在測濃度的時候,一定要把稀釋的樣品混勻,不然測得的結果會有大的偏差。