前言
血小板活化試驗,對于血小板功能、心血管疾病的研究,有重要意義。使用流式細胞儀進行多參數分析,可以特異、靈敏地檢測血小板表面標記,了解血小板的活化狀態和反應性,并同時獲得更多關于血小板的信息。在疾病監測、血小板疾病患者的篩選、預測并發癥等方面有良好的應用前景。
使用推薦的三色流式分析方法檢測血小板活化的優點是:
檢測血小板的反應性;了解血小板活化進程;血小板先發生膜糖蛋白變化,然后是胞漿內顆粒釋放到血小板外。同時檢測多種血小板表面標志;高度靈敏;直接檢測血小板的多種標志;使用全血,標本量少;操作簡便快捷,將血小板人工激活減至最低。
BDIS血小板活化試劑組成為:
PAC-1 FITC:血小板活化早期的標志物,即活化的 gpⅡb/Ⅲa復合物,抗體與活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa復合物纖維蛋白原結合位點相結合。BDIS抗體為IgM型,建議使用PAC-1結合阻斷劑RGDS做陰性對照。
CD62P PE:血小板活化后期的標志物,特異地與活化血小板結合。靜止血小板胞漿內a顆粒含有CD62P,血小板活化時,顆粒內糖蛋白向膜外釋放,血小板表面表達CD62P。
CD61 PerCP:特異的泛血小板表面標記,既與活化血小板結合,也與靜止的血小板結合。CD61與CD41聯合,即為血小板表面gpⅡb/Ⅲa復合物。在本試驗中,用FL3設閾值。
試驗用品
采血管:枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管;一次性12×75 mm Falcon試管;微量加樣器和加樣頭;BD抗體:2-8℃保存。
| 熒光抗體 | FITC | PE | PerCP |
| 對照管 | PAC-1+RGDS | IgG1 | CD61 |
| 試驗管 | PAC-1 | CD62P | CD61 |
RGDS (PAC-1阻斷劑):用PBS配制,10mg/ml。
血小板激活劑:ADP,濃度2×10-4M,2-8℃保存。也可選用其他激活劑,如PMA、纖維蛋白、TRAP。
PBS緩沖液:含0.1%NaN3,過濾后2-8℃保存。
固定液:含1%多聚甲醛的PBS緩沖液,2-8℃可保存一周。
振蕩混勻器。
FACS流式細胞儀:進行數據獲取。
CaliBRITE Beads/FACSComp軟件:FACS儀器校正,預設獲取條件。
CellQuest軟件:試驗數據獲取和分析軟件。