做好血液涂片和正確染色是血液細胞檢驗的重要步驟，涂片和染色效果的好壞直接關系著檢驗的結果，必須以認真負責的態度注意操作過程的每一個環節。
一．玻片的清潔
1．一般清洗法
（1） 將玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分鐘。
（2） 用熱水將肥皂和血膜等污物洗去，再用自來水反復沖洗，最后再用蒸餾水沖洗3 ～5 次。必要時再置95%乙醇中浸泡1小時，然后擦干或烘干備用。 新玻片常有游離堿質，因此應用清潔液或10 %鹽酸浸泡24小時，然后分別用自來水及蒸餾水徹底洗滌。
2．油污載片清洗法
（1） 清洗液
甲液：10g/L的過錳酸鉀水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。
（2） 清洗方法：將用過的玻片投入甲液數小時，取出后再投入乙液數小時，然后用自來水和蒸餾水沖洗干凈后再置95%乙醇中，以毛巾擦干凈即成。久用后甲液可出現泥沙樣沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花濾去再用，如乙液褪色應重新配置。
二．血涂片制作
取末梢血1滴，置載玻片一端，取另一邊緣光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接觸血滴后稍停。血液即沿推片散開，將推片與載片保持30
～45°角，向前平穩均勻推動推片，載片上便留下一層薄血膜。血涂片制成后，立即在空氣中揮動，使其迅速干燥，以免血細胞變形。血膜干燥后，用鉛筆在血膜的一側寫上病人姓名或編號。
一張良好的血片，厚薄要適宜，頭體尾要明顯，細胞分布要均勻，膜的邊緣要整齊，并留有一定的空隙。
涂片時，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快則血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白細胞集中于邊緣或尾部，不利于白細胞分類。如果血膜分布不勻，主要是推片不整齊，用力不均勻，載片不清潔所致。
三．染色
1．瑞氏染色法 （Wright staining）
本法的特點是將固定和染色合并在一起進行，手續簡便，染色時間短，對白細胞中 的特異性顆粒著色較好，但對核的著色較差。
（1） 原理 瑞氏染粉是由伊紅和美藍混合后組成的一種中性鹽染料。伊紅是一種酸性染料，為伊紅鈉鹽，其有色部分為陰離子；美藍是一種堿性染料，為氯化美藍，有色基團為陽離 子。如以M+代表美藍，以E-代表伊紅，其反應式為：
M+Cl- +Na+E→ ME↓+NaCl
美藍 伊紅 伊紅化美藍（瑞士染料）
將適量的ME溶解在甲醇中，即成為瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解離為M+和E－，這兩種有色離子可以選擇性地吸附血細胞內的不同成分而著色。甲醇的另一個作用是有很強的脫水作用，可將細胞固定為一定形態，當細胞發生凝固時，蛋白質被沉淀為顆粒狀或者網狀結構，增加細胞結構的表面積，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。
細胞的著色過程是染料透入被染物并存留其內部的一種過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學親和作用。各種細胞及細胞的各種成分由于其化學性質不同，對各種染料的親和力也不一樣，因此，在血片上可以見到不同的著色。細胞中堿性物質與酸性染料伊紅結合染成紅色，因此該物質又稱為嗜酸性物質。如，紅細胞中的血紅蛋白，嗜酸
性粒細胞胞漿中的顆粒為堿性物質，這些物質可與伊紅結合染成紅色。細胞中的酸性物質可與染液中的堿性染料美藍結合染成藍色，該物質又稱嗜堿性物質，如：嗜堿性粒細胞中的顆粒為酸性物質可與堿性染料美藍結合染成藍色。細胞核主要由脫氧核糖核酸和
強堿性的組蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所組成，這種強堿性的物質與瑞氏染液中的酸
性染料伊紅結合成紅色，但因為核蛋白中還有少量的弱酸性物質，它們又與染料中的堿
性染料美藍作用染成藍色。但因含量太少，藍色反應極弱，故核染色呈現紫紅色。幼稚
紅細胞的胞漿和細胞核的核仁中含有酸性物質，它們與染液中的堿性染料美藍有親和
力，故染成藍色。當細胞含酸、堿性物質各半時，它們既與酸性染料作用，又與堿性染
料作用，染成紅藍色或灰紅色，即所謂多嗜性。當胞漿中的酸性物質消失時，只與染液 中的伊紅起作用，則染成紅色，即所謂正色性。
（2） 試劑
①.瑞氏染液
瑞氏染料 （粉） 1．0g
純甲醇 （AR 級以上） 600．0 ml
將全部染料放入乳缽內，先加少量甲醇慢慢地研磨 （至少半小時），以使染料充分 溶解，再加一些甲醇混勻，然后將溶解的部分倒人潔凈的棕色瓶內，乳缽內剩余的未溶 解的染料，再加入少許甲醇細研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止。 密閉保存。
②.磷酸鹽緩沖液 （pH6．4 ～6．8）
磷酸二氫鉀 （KH2PO4） 0．3g
磷酸氫二鈉 （Na2 HPO4） 0．2g
蒸餾水 加至1000．0ml
配好后用磷酸鹽溶液校正pH ，如無緩沖液可用新鮮蒸餾水代替。
（3） 操作
①用蠟筆在血膜兩頭劃線，以防染液溢出，然后將血膜平放在染色架上。
②用瑞氏染液3 ～5滴覆蓋整個血膜，固定細胞0．5 ～1分鐘。
③滴加等量或稍多的緩沖液，用吸球將其與染液吹勻，或者搖動玻片染色5 ～10分鐘。
④慢慢搖動玻片，然后用流動水從玻片的一側沖去染液，待血片自然干燥后 （或用濾紙吸干），即可鏡檢。
2．姬姆薩染色法 （Giemsa staining）
（1）原理 姬姆薩染料由天青、伊紅組成，其染色原理與瑞氏染色法基本相同，但姬姆薩染色
法對細胞核著色較好，結構顯示更清晰，而對胞漿和中性顆粒則染色較差。
（2）試劑
姬姆薩 （Giemsa） 染料 1．0g 甘油 66．0ml 甲醇 66．0ml
將1．0g
姬姆薩染料粉末全部倒入盛有66．0ml 甘油的圓錐燒瓶內，在56 ℃的水浴鍋 上加熱90 ～120
分鐘，使染料與甘油充分混勻溶解，然后加入60 ℃預熱的甲醇，充分搖 勻后置棕色瓶中，于室溫下7
天，過濾后才能使用。此種染液放置時間愈久，細胞著色 越佳。
（3）操作
①.將干燥血片用甲醇固定3 ～5 分鐘。
②.將固定的血片置于被pH6．4 ～6．8 磷酸鹽緩沖液 （同瑞氏染色） 稀釋10 ～20 倍的 姬姆薩染液中，浸染10 ～30 分鐘 （標本較少可用滴染法）。
③.取出用水沖洗，待干后鏡檢。
3．瑞氏姬姆薩混合一次染色法
I 液：取瑞氏染粉1g 、姬姆薩染粉0．3g，置潔凈研缽中，加少量甲醇（分析純） 研 磨片刻，吸出上層染液。再加少量甲醇，繼續研磨，再吸出上液。如此連續幾次，共用 甲醇500ml，收集于棕色瓶中，每天早、晚各振搖3分鐘，共5天，以后存放1周即能使用。
Ⅱ液：pH6．4 ～6．8 磷酸鹽緩沖液
磷酸二氫鉀 （無水） 6．64g 磷酸氫二鉀 （無水） 2．56g 加少量蒸餾水溶解，用磷酸鹽調整pH ，加水至1000ml。
操作 平置玻片于染色架上，滴加染液3 ～5 滴，使其迅速蓋滿血膜，約1 分鐘后， 滴加緩沖液5 ～10 滴，輕輕搖動玻片或對準血片吹氣，與染液充分混合，5 ～10分鐘后 用水沖去染液，待干。
四．血涂片的質量控制
1．血膜片的質量要求是厚薄均勻適度，低倍鏡下觀察全片，細胞不重疊，頭尾及 兩側有一定的空隙，血膜頭部有明確的病人標志。
2．些體積較大的特殊細胞常在血膜的尾部出現，因此蠟筆劃線時應注意保存血膜 尾部細胞，血膜必須充分干燥，否則在染色過程中容易脫落。
3．配制染料須用優質甲醇，稀釋染液用緩沖液，因為緩沖液的pH
對細胞染色的影響很重要。在偏酸性環境中正電荷增多，在偏堿性環境中負電荷增多，又因為細胞著色
對氫離子濃度十分敏感。如果染色偏堿，原是紫紅色的中性顆粒則染成深藍色，造成識 別困難。沖洗須用中性水，雖亦可用自來水 （但不能保持穩定）。
4．對所用染液應進行預染試驗，新配制的染液放置一段時間后其中的美藍逐漸氧
化成天青B ，天青B 對細胞核的著色效果比美藍好，因此，瑞氏染液放置時間越長染色
效果越好，臨床上稱之為成熟。判斷染液成熟程度的簡易方法是用正常優質血片做預染
試驗，先用低倍鏡觀察載有染液的血片，認為著色滿意后，再按照染色后沖洗順序最后
用油鏡鏡檢，這樣不僅可了解染液的成熟程度，而且還可以選擇合適的染色時間，供臨 床標本染色時參考。
5．染液與緩沖液的比例要適當，以1∶27
為宜。一般說來緩沖液稀釋度愈大，染色 時間愈長，細胞著色愈勻稱、鮮艷。緩沖液和染液量要充足，否則染液很快蒸發，染料
沉淀于細胞上，使細胞深染而無法檢查。細胞較多較厚的涂片 （如紅細胞增多癥） 染液 應多些。細胞較少的涂片染液應少些。
6．染色時間與染液濃度、室溫高低、細胞多少有關，染液愈淡，室溫越低，細胞 愈多，所需時間越長，應適當增加染液濃度，因此必須根據情況靈活掌握。
7．染色良好的血膜片，外觀呈淺紅色，紅細胞呈粉紅色，白細胞核呈暗紫紅色， 染色質結構能辨，粒細胞的顆粒呈固有種異顏色。