血液3羥3甲戊二酰輔酶A(HMGCOA)還原酶光譜法

實驗概要

本實驗介紹了血液3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶光譜法的操作流程，該方法是一種旨在運用3-羥-3-甲戊二酰輔酶A作為底物，在還原酶的催化下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定血液樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。

實驗原理

甲戊二羥酸通路(mevalonate   pathway)，又稱為3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶通路或甲戊二羥酸依賴性通路，是所有高等真核生物和許多細菌具有的重要的細胞代謝通路，用于體內產生二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallyl  pyrophosphate；DMAPP)和異戊二烯焦磷酸(isopentenyl  pyrophosphate；IPP)作為生物大分子合成的基礎，包括蛋白質異戊二烯化、細胞膜維護、激素合成、蛋白固著、蛋白糖化等。3-羥-3-甲戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA   reductase；HMGR；EC1.1.1.34)是控制甲戊二羥酸通路的關鍵的酶，調節膽固醇和類異戊二烯脂分子的產生。HMG-COA還原酶位于內質網膜上，含有8個跨膜結構域，其中活性結構域在細胞漿里。HMG-COA還原酶是許多降脂藥物的靶標，包括lovastatin  (Mevacor)、atorvastatin  (Lipitor)、pravastatin(Pravachol)和simvastatin(Zocor)。在HMG-COA還原酶的催化下，將4個電子的3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原為甲戊二羥酸(mevalonate)，同時產生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced  nicotinamide adenine dinucleotide  phosphate；NADPH)被氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(oxidized nicotinamide adenine  dinucleotide phosphate；NADP)，其氧化后的吸光峰值變化(340nm  波長)，來定量分析3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶的活性。

主要設備

1. 抗凝管：用于血液樣品采集的容器
2. 1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
3. (微型)臺式離心機：用于樣品制備
4. 比色皿或酶標板：用于光譜分析的容器
5. 分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析

實驗步驟

1. 樣品準備

   1) 血漿樣品
      a. 準備好抗凝管；
      b. 抽取1毫升血液，置于抗凝管里；
      c. 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g(或5000 RPM，例如eppendorf 5415)；
      d. 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管-此為血漿成分(注意：避免觸碰白色液體層)；
      e. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1)；
      f. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存。
   2) 血清樣品
      a. 準備好不含抗凝劑的儲存管(注意：避免使用溶血樣品)；
      b. 抽取1毫升血液，置于儲存管里；
      c. 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結；
      d. 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g(或5000 RPM，例如eppendorf 5415)；
      e. 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管-此為血清成分(注意：避免觸碰白色液體層)；
      f. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1)；
      g. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存。
   3) 紅細胞樣品
      a. 準備好抗凝管；
      b. 抽取1毫升血液，置于抗凝管里；
      c. 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g(或5000 RPM，例如eppendorf 5415)；
      d. 小心抽去上層黃色液體 (注意：避免觸碰白色液體層)；
      e. 小心移取500微升管底紅細胞到新的1.5毫升離心管(注意：避免觸碰上面白色液體層)；
      f. 加入500微升預冷的無離子水；
      g. 渦旋震蕩15秒；
      h. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-2GMS30030.1)；
      i. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存。
2. 測定準備
   1) 開啟并設定好分光光度儀(溫度為37℃)：波長340nm，間隔5分鐘，讀數2次(共10分鐘)，并置零；
   2) 從-20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；GENMED反應液(Reagent B)和GENMED底物液(Reagent C)避免光照。
3. 背景對照測定
   1) 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent A)到新的比色皿；
   2) 加入xx微升GENMED反應液(Reagent B)；
   3) 加入xx微升GENMED底物液(Reagent C)；
   4) 上下傾倒數次，混勻；
   5) 在37℃溫度下孵育3分鐘；
   6) 加入xx微升GENMED陰性液(Reagent D)；
   7) 上下傾倒數次，混勻(限定在3秒之內)；
   8) 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照(0分鐘讀數－10分鐘讀數)。
4. 樣品測定
   1) 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent A)到新的比色皿；
   2) 加入xx微升GENMED反應液(Reagent B)；
   3) 加入xx微升GENMED底物液(Reagent C)；
   4) 上下傾倒數次，混勻；
   5) 在37℃溫度下孵育3分鐘；
   6) 加入20微升待測樣品(500微克蛋白)(注意：樣品須清澈)；
   7) 上下傾倒數次，混勻(限定在3秒之內)；
   8) 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(0分鐘讀數－10分鐘讀數)。
5. 計算樣品活性
[(樣品讀數－背景讀數)X樣品稀釋倍數X (分鐘)]＝單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADPH /分鐘
6. 酶標板測定
   1) 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品；
   2) 分別移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent A)到96孔板中；
   3) 分別加入xx微升GENMED反應液(Reagent B)；
   4) 分別加入xx微升GENMED底物液(Reagent C)；
   5) 輕輕搖動96孔酶標板；
   6) 在37℃溫度下孵育3分鐘；
   7) 分別加入xx微升GENMED陰性液(Reagent D)或待測樣品(500微克蛋白)到相應孔中(注意：樣品須清澈)；
   8) 輕輕搖動酶標板；
   9) 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和10分鐘讀數；
   10) 活性計算：
單位＝微摩爾長NADPH /分鐘

注意事項

1. 本產品為20次操作，包括背景對照；
2. 操作時，須戴手套；
3. 系統操作過程中，背景測定只需1次；
4. 建議使用比色皿測定；
5. 樣品須澄清，至關重要；
6. 加樣后3秒內光譜測定；
7. 測定值由高到低變化；測定持續10分鐘；
8. 光譜測定后，比色皿須清洗徹底；
9. 樣本測定0分鐘讀數高于10分鐘讀數表明具有酶活性；
10. 如果10分鐘讀數高于0分鐘讀數，表明樣本沒有活性或檢測不到；
11. 建議待測樣本蛋白濃度為500微克/20微升；
12. 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度；
13. 通常細胞3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶活性很低，為皮摩爾級，吸光讀數差值微小；
14. 如果樣本干擾較大，建議使用GENMED血液3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶活性比色法定量檢測試劑盒-GMS50358.3；
15. 3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內氧化1納摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)所需的酶量作為一個活性單位。