一、試劑和器材
1．試劑
(1）消化液30％過氧化氫與硫酸與水的比例為3:2:1，即在1 份的蒸餾水中緩慢加入2 份的硫酸，待冷卻后，將其加到3 份的過氧化氫中。臨用時配制。
(2) 催化劑 硫酸銅（CuSO4·5H2O ）與硫酸鉀（K2SO4）以1 : 3 配比研磨混合。
(3）40 ％氫氧化鈉溶液 (4) 2 ％硼酸溶液
（5）標準鹽酸溶液（約 0.0100mol/L) (6）混合指示劑（田氏指示劑）混合指示劑由50ml 0.1％甲烯藍乙醇溶液與200ml 0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成。
貯于棕色瓶中備用。這種指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色，變色范圍很窄且很靈敏。
2.器材
消化管或凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、電爐、100ml 錐形瓶、5ml 酸式滴定管。
一、操作方法
（一）微量凱氏定氮儀的構造和安裝
凱氏定氮儀由蒸汽發生器、反應室、冷凝管三部分組成。蒸汽發生器包括一個電爐及一個3-5
升容積的燒瓶。蒸汽發生器借橡皮管與反應室相連。反應室上邊有二個小燒杯，一個供加樣用，一個盛放堿液。樣品和堿液由此可直接到反應室中。反應室中心有一長玻璃管，其上端通到反應室外層，下端靠近反應室的底部。反應室下端底部有一開口，上有橡皮管和管夾。由此放出反應廢液。反應所產生的氨可通過反應室上端細管經
冷凝管通入收集瓶中。反應室與冷凝管之間由橡皮管相連。安裝儀器時，將蒸汽發生器垂直地固定在鐵架臺上，用橡皮管把蒸汽發生器、反應室、冷凝管連接起來。橡皮管連接的部位應在同一水平位置。冷凝管下端與實驗臺的距離以放得下收集瓶為準。安裝完畢后，不得輕易移動，以免儀器損壞。要認真檢查整個裝置是否漏氣，以保證所測結果的準確性。
（二）樣品的處理
1．固體樣品 隨機取一定量研磨細的樣品放入恒重的稱量瓶中，置于105℃ 的烘箱中干燥4h ，用增鍋鉗將稱量瓶取出放入干燥器內，待降至室溫后稱重，隨后繼續干燥樣品，每干燥lh，稱重一次，恒重即可。
2．血清樣品 取人血（或豬血）放入離心管中，干冰箱中放置過夜。次日離心除去血凝塊，上層透明清液，即為血清。吸出lml 血清加到50ml 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻備用。溶液如果顯渾濁，加少量氯化鈉再混勻。
（三）消化
取5 支消化管并編號，在1 、2 、3 號管中各加入精確稱取的干燥樣品（注意：加樣品時應直接送入管底，避免沾到管口和管頸上）,
加催化劑05g，混合消化液3ml ，在4 、5
號管中各加相同量的催化劑和混合消化液（若樣品是液體時，還要加與樣品等體積的蒸餾水）作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質。搖勻后，將5
支消化管放在通風廚內的遠紅外消煮爐上消化。先用小火加熱煮沸，不久看到消化管內物質
碳化變黑，并產生大量泡沫，此時要特別注意，不能讓黑色物質丘升到消化管的頸部，否則將嚴重地影響樣品測定結果。當混合物停止冒泡，蒸汽與二氧化碳也均勻地放出時，適當加強火力。在消化時，應使全部樣品都浸泡在消化液中，如在瓶頸t
發現有黑色顆粒，應小心地將消化管傾斜振搖，用消化液將它沖洗下來。通常消化需要1-3h（對于那些賴氨酸含量較高的樣品需要更長的時間）。待消化液變成褐色后，為了加速消化完成，可將消化管取出，稍冷，加30％過氧化氫溶液1-2
滴于管底消化液中，再繼續消化，直到消化液由淡黃色變成清晰的淡藍綠色，消化即告成功。為了保證消化徹底，再繼續加熱0.5h
。消化完畢，取出消化管冷卻至室溫。
（四）蒸餾
1．儀器的洗滌
儀器應先經一般洗滌，再經水蒸汽洗滌。目的在于洗去冷凝管中可能殘留的氨。對于處于使用狀態的儀器（正在測定中的儀器）加樣前使蒸汽通過1-2min
即可，對于較長時間未使用的儀器，必須用水蒸汽洗滌到吸收蒸汽的硼酸一指示劑混合液中指示劑的顏色合格為止。洗滌方法如下：取2-3 個100ml
錐形瓶，加入10m1 2％硼酸、2 滴混合指示劑，用表面皿覆蓋備用。先煮沸蒸汽發生器，器中盛有2/3
體積的用幾滴硫酸酸化過的蒸餾水，樣品杯中也加入2/ 3
體積蒸餾水進行水封。關閉夾子使蒸汽通過反應室中的插管進入反應室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空燒杯以承受凝集水滴。這樣用蒸汽洗滌5min
左右，在冷
凝管下口放一個準備好的盛有硼酸-指示劑的錐形瓶，位置傾斜，冷凝管下口應完全浸泡于液體內，繼續用蒸汽洗滌 1-2 min
，觀察錐形瓶中的溶液是否基本上不變色，若不變色，則證明蒸餾器內部已洗滌干凈。下移錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管口約 1cm ，繼續通蒸汽 lmin
。最后用蒸餾水沖洗冷凝管外口，排廢開始。用右手輕提樣品杯中棒狀玻塞，使水流入反應室的同時，立即用左手關閉夾子，蓋好玻塞。由于反應室外層中蒸汽冷縮、壓力降低，反應室內廢液通過反應室中插管自動抽到反應室外殼中，再在樣品杯中加入
2 / 3 體積蒸餾水，如此反復三次即可排盡廢液及洗滌液。打開夾子將反應室外殼中積存的廢液排出，關閉夾子再使蒸汽通過全套蒸餾儀 1-3min
，可進行下一次蒸餾。
2．樣品及空白的蒸餾 取5 個100ml 錐形瓶，分別加入2％硼酸 10ml ，混合指示劑2
滴，溶液呈紫紅色，用表面皿覆蓋備用。把消化管中的消化液全部轉移到樣品杯中，用約2ml 蒸餾水沖洗消化管，重復 3
次，把洗滌液都倒入樣品杯中，打開樣品杯的棒狀玻塞，將樣品放入反應室，用少量燕溜水沖洗樣品杯后也使之流入反應室，蓋上玻塞，并在樣品杯中加約2/3
體積的蒸餾水進行水封。而后將裝有硼酸一指示劑的錐形瓶放在冷
凝管口下方，打開存放堿液杯下端的夾子，放
10ml40％氫氧化鈉溶液于反應室后，立即上提錐形瓶，使冷凝管下口浸沒在錐形瓶的液面下。反應液沸騰后，錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由紫紅色變為綠色，自變色時起計時，蒸餾
3-5min，移動錐形瓶，使硼酸液面離開約1cm
，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口外面，繼續蒸餾lmin，將錐形瓶取出，用表面皿覆蓋以待滴定。排廢和洗滌等操作與前面相同。排廢洗滌后，可進行下一個樣品的蒸餾（每一個樣品要同時做三份，以求得準確結果）。待樣品和空白消化液蒸餾完畢后，同時進行滴定。
（五）滴定
全部蒸餾完畢后，用 0.0100mol/I 標準鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。
（六）計算
樣品的總氮含量（g 氮/%）= ( A-B )×0.0100×14×100/ (C×1000)
若測定的樣品含氮部分只是蛋白質，（如血清）則：
樣品中的蛋白含量（g / % ) = ( A-B )×0.0100×14×6.25×100/ (C×1000)式中： A
為滴定樣品用去的鹽酸體積（ml ) ; B 為滴定空白用去的鹽酸體積（ml ) ; C為稱量樣品的量（g ) ; 0 . 0100
為鹽酸的摩爾濃度（ mol/l ) （實際上，此項應按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫） ; 14 為氮原子量；6.25 為系數（1
ml0.01mol / I 鹽酸相當于0.14mg
氮）。若樣品中除有蛋白質外，尚有其它含氮物質，則樣品蛋白質含量的測定要復雜一些。首先，需向樣品中加入三氯乙酸，使其最終濃度為5 %
，然后測定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，從而計算出蛋白氮，再進一步折算出蛋白質含量。
蛋白氮＝總氮-非蛋白氮蛋白質含量（g/％) ＝蛋白氮×6.25
IV 透析
原理：透析是利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽、單糖等分開。常用的半透膜是玻璃紙或稱塞璐玢紙、火棉紙或稱塞璐錠紙盒其他改型的纖維素材料，透析時把待純化的蛋白質溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內無機鹽等小分子物質降低到最小值為止。
一、試劑和器材
1．試劑
EDTA，NaCO3，NaOH。
2．器材
電爐，磁力攪拌器，500ml 燒杯
二、操作過程
1．透析袋的預處理：取100ml 0.01mol/l 的EDTA 溶液，加入1gNaCO3，溶解后用NaOH 調pH
值為7.0；將透析袋剪成適宜長度，放入EDTA 溶液中煮沸10 分鐘，然后用蒸餾水沖洗，再用EDTA 溶液煮10 分鐘，反復處理4-5
次，在蒸餾水中與4℃保存備用。
2．透析：將樣品放入透析袋內，兩端封閉（注意袋內不要留氣泡），放入透析液中在磁力攪拌器上透析。