VI 凝膠層析法分離純化蛋白質
一、目的
了解凝膠層析的基本原理，并學會用凝膠層析分離純化蛋白質。
二、原理
凝膠層析也稱凝膠過濾、凝膠過濾層析、分子排阻層析和分子篩層析。凝膠是具有一定孔徑的網狀結構物質，凝膠層析是一種分子篩效應，主要用于分離分子大小不同的生物大分子以及測定其相對分子質量。相對分子質量小的物質可通過凝膠網孔進人凝膠顆粒的內部，而相對分子質量大的物質不能進人凝膠內部，被排阻在凝膠顆粒之外，隨著洗脫的進行，相對分子質量小的物質由于進人凝膠內部，不斷地從一個網孔穿到另一個網孔，這樣“繞道”而移動，走的路程長，下來得慢（遷移速度慢），而相對分子質量大的物質因不能進人凝膠內部即隨洗脫液從凝膠顆粒之間的空隙擠落下來，走的路程短，下來得快（遷移速度映），這樣就可達到分離的目的。
目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠（商品名sephadex）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名Bio-
GelP）、瓊脂糖凝膠（商品名因生產廠家而不同，如瑞典的Sepharose ，美國的Bio-Ge1
A)，其中最常用的是sephadex。sephadex 有各種不同型號，用于分離相對分子質量大小不同的物質。
三、實驗器材
1．層析柱1cm×90cm
2．恒流泵
3．紫外檢測儀
4．部分收集器
5．記錄儀
6．試管等普通玻璃器皿
四、實驗試劑
1．待分離樣品：胰島素、牛血清白蛋白等
2．葡聚糖凝膠Sephadex G-75
3．藍色葡聚糖2000
4．洗脫液：0.1lmol/l pH6.8 磷酸緩沖液
五、操作
1．凝膠的處理
Sephadex G-75 干粉經蒸餾水室溫充分溶脹24h ，或沸水浴中3h
，這樣可大大縮短溶脹時間，而且可以殺死細菌和排除凝膠內部的氣泡。溶脹過程中注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。凝膠顆粒大小要求均勻，使流速穩定。凝膠充分溶脹后用傾泌法將不易沉下的較細顆粒除去。
將溶脹后的凝膠抽干，用10 倍體積的洗脫液處理約lh ，攪拌后繼續用傾泌法除去懸浮的較細顆粒。
2．裝柱
將層析柱垂直裝好，關閉出口，加人洗脫液約Icm 高。將處理好的凝膠用等體積洗脫液攪成漿狀，自柱頂部沿管內壁緩緩加人柱中，待底部凝膠沉積約Icm
高時，再打開出口，繼續加人凝膠漿，至凝膠沉積至一定高度（約70cm ) 即可。裝柱要求連續，均勻，無氣泡，無“紋路”。
3．平衡
將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱人口相連，用2 一3 倍床體積的洗脫液平衡，流速為0.5ml / min 。平衡好后在凝膠表面放一片濾紙，以防加樣時凝膠被沖起。
柱裝好和平衡后可用藍色葡聚糖2 000 檢查層析行為，在層析柱內加lml ( 2mg / ml ）藍色葡聚糖2 000 ，然后用洗脫液進行洗脫（流0.5ml／rnin ) ，若色帶狹窄并均勻下降，說明裝柱良好，然后再用2 倍床體積的洗脫液平衡。
4．加樣與洗脫
將柱中多余的液體放出，使液面剛好蓋過凝膠，關閉出口，將1
司樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時關閉出口，用少量洗脫液洗柱內壁2 次，加洗脫液至液層4cm
左右，按上恒流泵，調好流速（0.5ml / rn in ) ，開始洗脫。上樣的體積，分析用量一般為床體積的1％一2%
，制備用量一般為床體積的20％一30％。
5．收集與測定
用部分收集器收集洗脫液，每管4ml。紫外檢測儀280nm 處檢測，用記錄儀或將檢測信號輸人色譜工作站系統，繪制洗脫曲線。
6．凝膠柱的處理
一般凝膠用過后，反復用蒸餾水通過柱（2 一3 倍床體積）即可，若凝膠有顏色或比較臟，需用0.5mol/l NaOH 一0.5mol/l NaCI 洗滌，再用蒸餾水洗。冬季一般放2 個月無長霉情況，但在夏季如不用，則要加0.02％的疊氮鈉防腐。
VII SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子質量
一、目的
了解SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳法的原理，并學會用這種方法測定蛋白質的相對分子質量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質量。SDS
是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一個因素，就可根據標準蛋白質的相對分子質量的對數對遷移率所作的標準曲線求得未知蛋白質的相對分子質量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可以用圓盤電泳，也可以用垂直平板電泳，本實驗用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點一致，便于比較。
三、實驗器材
1．直流穩壓電泳儀。
2．垂直平板電泳槽。
3．移液器（1.0ml 、200ul 、20ul ）。
4．微量注射器（20ul ）。
5．燒杯、試管、滴管、直尺等
四、實驗試荊
1．凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr ) 29.2g，亞甲基雙丙烯酞胺（Bis ) 0.8g, 加重蒸水至100ml 。外包錫紙，4℃ 冰箱保存，30 天以內使用。
2．分離膠緩沖液：1.5mol/lTris-HCI , pH8.8。
18.15 Tris（三經甲基氨基甲烷），加約80ml 重蒸水，用lmol/lHCI 調pH 到8.8，用重蒸水稀釋至最終體積為l00ml, 4℃冰箱保存。
3．濃縮膠緩沖液：0.5mol/lTris-HCI , pH6.8。
6gTris，加約60ml 重蒸水，用lmol/lHCI 調pH 至6.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml,4℃冰箱保存。
4．10%SDS，室溫保存。
5．兩類樣品緩沖液：
(l) 2 倍還原緩沖液
0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml
甘油 2.0ml
質量濃度10%SDS 4.0ml
質量濃度0.1％溴酚藍 0.5ml
β-巰基乙醇 1.0ml
總體積 10ml
(2) 2 倍非還原緩沖液
重蒸水 1.0ml
0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml
甘油 2.0ml
質量濃度10% SDS 4.0ml
質量濃度0.1％溴酚藍 0.5ml
總體積 10ml
6．電極緩沖液，pH8.3 。
Tris 3g，甘氨酸14.4g,SDS 1.0g，加重蒸水至1000ml , 4℃ 冰箱保存。