實驗方法原理 本方法是由 Jaffe 等 [ 1973 ] 的方法改寫的。
實驗材料 D-PBSA胰蛋白酶EDTA人臍帶膠原蛋內酶H冷的新生小牛血
試劑、試劑盒 Hank平衡鹽溶液HBSS PSG70%乙醇HUVRC生長培養液
儀器、耗材 培養瓶手術刀和22號刀片手術針20ml注射器鱷魚夾動脈夾尖頭剪棉紙鋁箔塑料薄膜或莎綸封皮軟木板很堅韌的線Luer接合管
實驗步驟
內皮細胞的分離
1. 用鋁箔覆蓋軟木板。
2. 將棉紙鋪在鋁箔上面，然后用 70 % 乙醇浸泡。
3. 擠出臍帶中的血液。
4. 切除臍帶一端 2 cm 或 2 cm 以上，包括動脈夾痕跡處。
5. 將 Luer 接合管外套插入靜脈。
6. 用針將臍帶釘在軟木板上，但注意勿穿經血管腔。
7. 用手術刀和手術鑷剝出一段靜脈，長約 2 cm。
8. 縫線固定接合管，緊緊打結兩次。
9. 夾閉臍帶另一端，將 20 ml 注射器接在接合管上，再將 25 ml D-PBSA （放在冰上）注入臍帶。靠 D-PBSA 的壓力將靜脈擴張。檢査臍帶是否有小孔。如有小孔，用鱷魚夾夾持臍帶，使小孔閉合，但不要夾閉靜脈。
10. 將 D-PBSA 自臍帶排人廢液瓶。
11. 切除臍帶另一端，插入接合管，如步驟 8 縫線固定。
12. 用另一只注射器將 25 ml 膠原蛋白酶液（膠原蛋內酶 H：是從溶組織梭狀芽孢桿菌提純的（1074059，Roche）。0.5 mg/ml， 用 M199 配制 25 ml）注入臍帶，直至臍帶膨脹。
13. 用乙醇噴過的塑料薄膜將臍帶包裹，在 37°C 條件下放置 8 min。
14. 將膠原蛋白酶液擠出臍帶，同時回抽注射器。
15. 拔出注射器，將膠原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS（冷的新生小牛血清，5 ml） 的試管。
16. 在臍帶另一端換注射器，將 25 ml D-PBSA 注入臍帶。
17. 擠壓或拍打整段臍帶一會兒，然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。
18. 將抽取的 D-PBSA 注入在步驟 15 使用的試管。
19. 在 4°C 條件下離心（210 g，10 min）。
20. 用 5 ml HUVFC 生長培養液混懸細胞。
21. 吸去培養瓶內多余的明膠溶液，接種細胞。
22. 第 2 天從培養瓶吸去培養液。
23. 用 D-PBSA 洗兩次，然后加入 HUVEC 生長培養液（M 199 培養液，添加 Hank 鹽、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液以及從牛腦提純的內皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）。使用 Roche 公司生產的 EGGS （1033484，75 mg）時，25 μg/ml，并用 5 μg/ml 肝素，也可使用 Sigma 公司的產品（E2759，15 mg），30 μg/ml，并用 10 μg/ml 肝素）。
維持培養
24. 吸去一半培養液，加入新鮮培養液，每周 3 次。
25. 大約每周傳代一次。將胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培養瓶，收集細胞，然后按 1 : 2 傳代。
26. 不要使用超過 6 代的細胞。