血細胞分離培養方法和步驟1

以前認為紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等血細胞都屬終末分化細胞，很難在體外培養生長或僅能短期培養而不能傳代，近年來由于細胞培養技術的發展，已有血細胞培養成功的報道，正常血細胞在體外培養生長時間短，只有白血病細胞，血友病細胞、淋巴瘤細胞可培養成功并建立細胞系，但多半為EB病毒等致瘤病毒引起的轉化細胞，（EBNA檢查陽性），二甲基亞砜（DMSO）處理也可誘導這些細胞分化發生逆轉，表現為正常細胞。所建立的細胞系多半為單核細胞系、B淋巴細胞系、T淋巴細胞系，只在IL-2產品問世后，T細胞才可在體外建系、建株。
血細胞可從外周血中用梯度液通過離心分層后分離獲得。也可從脾臟、扁桃體、淋巴結中用機械法切碎過篩分離獲得淋巴細胞，從腹腔刺激后的沖洗液中可獲得大量的單核-巨噬細胞，從骨髓中可以獲得前提血細胞，并可長期培養生長。加入生長因子或某些物質有利于細胞純化并促進分化和生長繁殖，例如在淋巴細胞中加入IL-2（TCGF），可促進T細胞生長，建立T淋巴細胞系。在多發性骨髓瘤細胞（B細胞）培養中，加B細胞生長因子，可建立B細胞系；加入IL-6（或正常淋巴細胞培養48h的培養上清中的IL6）可使B細胞在體外長期培養，建立了IL-6依賴的B9細胞系。在骨髓單個核細胞培養中加入二羥基維生素D3,可使單個核細胞分化為成骨細胞及破骨細胞。

（一）外周血細胞分離：
外周血中除紅細胞外，還有粒細胞、單核細胞和淋巴細胞及血小板等，通常是分離這些血細胞的重要來源。其分離方法有四種：自然沉降法、差異沉降法、氯化銨分離法、Ficoll分離法。
1、自然沉降法：
將無菌抗凝血放入試管中，在37℃水浴中靜置，自然沉降1-2h，可見到紅細胞下沉，并有明顯分層，上層血漿中富含有大量的 和淋巴細胞，下層主要為紅細胞。此方法簡便但各層中的細胞種類多，不純。血漿中雖以粒細胞、淋巴細胞為主，但也含有血小板，大單核細胞和少量紅細胞。下層雖以紅細胞為主，但也有上述各種細胞，此法適用于淋巴細胞轉化試驗。
2、差異沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明膠溶液無菌消毒后，分裝于中試管中，由于這些物質能使紅細胞形成“串狀”，比粒細胞、淋巴細胞沉降速度快，因而可使紅細胞與白細胞、淋巴細胞分離開。其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，經抗凝血5ml加入上層中混合后靜置于37℃水浴中30-60min，即可見紅細胞下沉，上層富含大量粒細胞和淋巴細胞，下層為紅細胞，使兩者易于分離開，取上層可用于粒細胞、淋巴細胞培養和實驗，下層可用于紅細胞培養和實驗，經PBS洗3次后即可加入培養基培養，可用于天然白細胞干擾素的誘生和生產。此法分離的細胞純度也不高。
3、氯化銨分離法：
0.83%氯化銨（NH4CL）可使紅細胞破裂，通常將分離獲得的粒細胞。淋巴細胞中混有的少量的紅細胞用0.83%氯化銨進行裂解，以排除紅細胞的干擾。另外，此法也適合大量粒細胞、淋巴細胞的分離制備，在天然白細胞干擾素誘生和生產中已被廣泛應用。方法如下：
將中心血站供應的健康人外周血離心分離白細胞黃層懸液先經2000r/min離心20min，吸出上清血漿，將下層的紅細胞、白細胞混合后，加入0.83氯化銨，用量為血細胞懸液液量的3倍，于4℃作用20min后離心棄去上清。
在沉淀層中再加入新鮮0.83氯化銨混勻后于4℃作用20min，以便徹底清除紅細胞，離心棄上清。
收貨下層的細胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/ml卡拉霉素）培養基制成懸液，調整細胞濃度為（8-10）x10^9個/L，分瓶加塞在37℃普通培養箱中旋轉培養（12r/h）。
混懸細胞時若加入干擾素誘導劑（NDV-F）誘導22h，收貨上清就可生產白細胞干擾素。此法分離的細胞純度更差。
4、Ficoll分離法：
采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴細胞分離液，通過2000r/min離心后可使血細胞以不同相對密度分離開，如分離淋巴細胞可選用相對密度1.077的分離液；若分離血小板可用相對密度1.090的分離液，若分離骨髓中的單核細胞常用相對密度1.120的分離液，現以淋巴細胞分離為例，方法如下。
取中心血站供應的抗凝血細胞或初步分離的白細胞黃層細胞懸液，用無鈣、鎂離子的PBS稀釋3-4倍。
將Ficoll淋巴細胞分離液事先分裝于離心管中，使其沉于管底，并在37℃中預熱。
用吸管將經稀釋的血細胞懸液沿離心管壁緩慢加入，不讓細胞懸液沖破分層液界面，使其懸于分層液上方。
以2000r/min離心20min后，不同細胞可依相對密度不同而分布于各位置上，由于紅細胞在Ficoll作用下成串下沉，故在離心管中分布在Ficoll層下方，淋巴細胞分布在Ficoll層上方。