摘要:行為學實驗是評價動物學習記憶能力的主要方法之一，本文選擇跳臺、穿梭箱和Morris水迷宮三種常用的行為學實驗，利用堿性蛋白酶水解制得的乳清蛋白膚，研究乳清蛋白膚對老齡小鼠學習記憶能力的影響。通過動物行為學實驗得出，灌胃乳清蛋白膚可以增加跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數;減小電擊時間和次數;減少定位航行實驗中的逃避潛伏期、游泳路程、速度和朝向角，增加空間探索實驗中的目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數和減少初次穿越平臺的時間，同時游泳軌跡也向趨向型和直線型發展。實驗結果表明，乳清蛋白膚能夠提高衰老小鼠的被動回避和空間學習記憶能力，所以通過本試驗可以為開發具有改善學習記憶能力的乳清蛋白膚產品提供理論依據。
關鍵詞:乳清蛋白膚;衰老小鼠;行為學實驗;記憶學習能力
0引言
近年來人們對乳清蛋白膚的研究逐漸成為熱點，目前已發現某些膚段具有抗氧化，降血壓’2，，降膽固醇，增強免疫力，抗毒，抗病菌’3，等多種生理功能，E.A. 1'era-Ramo、等研究發現乳清蛋白酶解物在脂質氧化體系中可以防止脂質過氧化，J，。Tuba 13ayr}'等酶解乳清蛋白，研究了其自由基清除能力，發現乳清蛋白膚具有良好的抗氧化活性;包怡紅等’川證實以全乳清為原料，利用堿性蛋白酶對乳清蛋白進行降解，水解后的多膚對Fenion體系產生的經自由基有清除能力。目前已經證實乳清蛋白膚能夠清除自由基iii，延緩機體衰老，因而可能也具有改善學習記憶的作用，但研究并不多見。木實驗選擇抗氧化活性最強的乳清蛋白膚的超濾組分進行動物行為學實驗，研究乳清蛋白膚對衰老小鼠學習記憶能力的影響。
1實驗
1.1材料與試劑
濃縮乳清蛋白，蛋白質質量分數78.29%，堿性蛋白酶，昆明種雌雄小鼠，毗拉西坦(腦復康，其余所有試劑均為分析純。
1.2主要儀器
紫外可見分光光度計，低速離心機，萬能粉碎機，RE-52型旋轉蒸發儀，XR-XM101型Morris水迷宮系統與XR-XC105型程控小鼠穿梭箱，XR-3TB型小鼠跳臺測試儀。
1.3方法
1.3.1乳清蛋白杭氧化膚的制備
乳清蛋白膚的制備參考卜輯的方法’“，，以Dl'1'H自由基清除率為指標，對乳清蛋白膚進行脫鹽、超濾分離，篩選出抗氧化活性最高的組分(分子量小于3 ku )，將其冷凍十燥成粉末，以備下一步實驗。
1.3.2動物行為學實驗
1.3.2.1實驗動物飼養及分組
動物飼養:取雌雄昆明種小鼠80只，購買自然衰老的老年小鼠18月齡，青年小鼠3月齡，適應性飼養1周后，用Morris水迷宮系統篩選，剔除漂在水面上的小鼠，剩余72只。隨機分組(見表1)，每組雌雄小鼠數目相等，分為青年對照組，老年模型組，腦復康對照組和乳清蛋白膚低、中、高劑量組，分籠飼養，雌雄不同籠。每組12只，每5天稱1次體質量，老年模型組和青年對照組每天注射等量生理鹽水。低、中、高劑量組注射的乳清蛋白膚溶液是由超濾分離出的分子量小于3 ku的寡膚凍十粉配制而成。
1.3.2.2行為學實驗
連續喂養30 d后，于第31天按照跳臺實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗的順序依次開始行為學實驗。
(1)跳臺實驗：實驗時先將小鼠放人反應箱內(臺上、臺下)適應環境3 min，然后將其放在銅柵上，立即通以3 f} V的交流電，觀察小鼠受到電擊跳回平臺以及再次跳至銅柵上的情況。如此訓練5 min，記錄每只小鼠受電擊的次數或稱錯誤次數(EN 1)，以此作為學習成績。24 h后和5 d后分別進行重復測驗，將小鼠置于平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的時間，即停留潛伏期(step-down latency, SDL)和各鼠3 min內的錯誤次數(EN 1)，以此作為記憶成績。停止實驗5d后再進行1次重復實驗，記錄上述指標，作為記憶消退階段的成績。
(2)穿梭箱實驗：實驗時將小鼠放人穿梭箱內任何一側，10、后開始出現蜂鳴音，持續S S，蜂鳴音后給予電刺激(100 V , 0.2 mA ,5o HZ,AC>，持續10 s。連續訓練4d，每天10次。記錄以下指標:電擊時間，即動物被電擊的累訓一時間;電擊次數，即在10個循環中小鼠被電擊到的次數。
(3)Morris水迷宮實驗：實驗時將平臺隨機置于第一象限并固定于水下1一1.5 cm，水溫保持在21 0C 1 1 0C 0整個實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。
①定位航行實驗:用于測量小鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，實驗歷時f} d，每天訓練4次。在距離平臺所在象限的較遠象限的水池壁上標定一點，作為實驗小鼠的人水點，實驗過程保持站臺位置和小鼠落水位置不變。將小鼠沿水池壁慢慢放人水中，通過Dig13e1m-MWM視頻分析系統記錄小鼠從投人水池至找到并爬上平臺的時間，此為定向航行實驗逃逸潛伏期，同時記錄游泳路程、游泳速度和朝向角，以此作為評價大鼠學習能力差異的指標，每次觀察時間為90 s，若設定時間內未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為90 s，然后通過引導使小鼠游上平臺并停留5S。每次試驗均在安靜的環境中進行，水池和光源的位置應保持不變。
②空間探索實驗:用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力，方法為第匕天撤去平臺，以訓練時的標定點作為人水點，將小鼠放人水中，記錄12n、內小鼠在目標象限(平臺所在象限)的停留時間、目標象限停留路程、準確穿越平臺所在位置的次數及初次穿越平臺時間等指標，作為空間搜索試驗的成績，以此來判斷小鼠對空間位置的短期記憶和判斷能力。
1.4統計分析
文中數據均使用S1'SS18.0軟件進行統計分析，所用數據均為三次的平均數，誤差項為標準誤，單因素方差分析(ANOVA)中采用LW ncan檢驗。文中采用Sigma Plot 9.0軟件作圖，圖表中標有相同字母者為差異不顯著，有不同字母者為差異顯著(1'0.05)0