補體結合試驗（complementfixationtest，CFT）是用免疫溶血機制做指示系統，來檢測另一反應系統抗原或抗體的試驗。早在1906年Wasermann就將其應用于梅毒的診斷，即著名的華氏反應。這一傳統的試驗經不斷改進，除了用于傳染病診斷和流行病學調查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關以原以及HLA的檢測和分析中也有應用。
一、類型及原理
該試驗中有5種成分參與反應，分屬于3個系統：①反應系統，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；②補體系統；③指示系統，即SRBC與相應溶血素，試驗時常將其預先結合在一起，形成致敏紅細胞。反應系統與指示系統爭奪補體系統，先加入反應系統給其以優先結合補體的機會。
如果反應系統中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發生反應后可結合補體；再加入指示系統時，由于反應液中已沒有游離的補體而不出現溶血，是為補體結合試驗陽性。如果反應系統中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統時會出現溶血，是為補體結合試驗陰性（圖14-2）。因此補體結合試驗可用已知抗原來檢測相應抗體，或用已知抗體來檢測相應抗原。
圖14-2補體結合試驗示意圖
二、試驗方法
補體結合試驗的改良方法較多，較常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后兩種方法應用較為廣泛，因為可以節省抗原，血清標本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細胞各加0.1ml，補體加0.2ml，總量為0.6ml。
（一）試劑
1．抗原試驗中用于檢測抗體的抗原應適當提純，純度愈高，特異性愈強。如使用粗制抗原時，須經同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應。
2．抗原和抗本的滴定補體結合試驗中，抗原與抗體按一定比例結合，因而應通過試驗選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強陽性反應（100％不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單價）。滴定方法舉例如表14-4。在試管中加入不同稀釋度的抗原，配加不同稀釋度的抗血清，另作不加抗原的抗體對照管和不加抗血清的抗原對照管。按照試驗方法加補體和指示系統，溫育后觀察結果。在表14-4中可見1:64抗原和1:32抗體各作為1個單位。在正式試驗中，抗原一般采用2～4個單位（1:64～1:32），抗體采用4個單位（1:8）。
表14-4抗原和抗體的方陣滴定
| 抗原 | 抗血清稀釋倍數 | 抗原對照 | |||||||
| 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | ||
| 1:4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 0 |
| 1:8 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 1:16 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 2 | ± | 0 |
| 1:32 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 1 | ± | 0 | 0 |
| 1:64 | 4 | 4 | 4 | ④ | 2 | ± | 0 | 0 | 0 |
| 1:128 | 4 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1:256 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1:512 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 抗體對照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
注：1、2、3、4分別表示溶血反應強度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0為不溶血。
3．補體滴定按表14-5逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補體能產生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。如形14-5中的結果為1:60的補體0.12ml可產生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X計算，X＝50；即實際應用中的2個補體實用單位應為1:50稀釋的補體0.2ml。
表14-5補體的滴定
| 管號 | 1:60補體（ml） | 緩沖液（ml） | 稀釋抗原（ml） | 致敏SRBC
（ml） |
結果 | ||
| 1 | 0.04 | 0.26 | 0.1 | 放
置 37℃水 浴30min |
0.2 | 放
置 37℃水 浴30min |
不溶血 |
| 2 | 0.06 | 0.24 | 0.1 | 0.2 | 不溶血 | ||
| 3 | 0.08 | 0.22 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
| 4 | 0.10 | 0.20 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
| 5 | 0.12 | 0.18 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 | ||
| 6 | 0.14 | 0.16 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 |
（二）血清標本
采集血液標本后及時分離血清，及時檢驗或將血清保存于－20℃。血清在試驗前應先加熱56℃30min（或60℃3min）以破壞補體和除去一些非特異因素。血清標本遇有抗補本現象時可做下列處理之一：①加熱提高12；②－20℃凍融后離心去沉淀；③以3mmol/L鹽酸處理；④加入少量補體后再加熱滅活；⑤以白陶土處理；⑥通入CO2；⑦以小白鼠肝粉處理；⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補體。
（三）正式試驗
以小量法測定抗體的補體結合試驗為例。按表14-6逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對照管，應與預期的結果吻合。陰性、陽性對照管中應分別為明確的溶血與不溶血；抗體或抗原對照管、待檢血清對照管、陽性和陰性對照的對照管都應完全溶血。綿羊紅細胞對照管不應出現自發性溶血。補體對照管應呈現2U為全溶，1U為全溶略帶有少許紅細胞，0.5U應不溶。如0.5U補體對照出現全溶表明補體用量過多；如2U對照管不出現溶血，說明補體用量不夠，對結果都有影響，應重復進行試驗。補體結合試驗結果，受檢血清不溶血為陽性，溶血為陰性。
表14-6測定抗體的補體結合試驗操作程序
| 反應物（ml） | 待檢血清管 | 陽性對照管 | 陰性對照管 | 抗原對照管 | 補體對照管 | 紅細胞對照管 | |||||
| 測定 | 對照 | 測定 | 對照 | 測定 | 對照 | 2U | 1U | 0.5U | |||
| 稀釋血清 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | － | － | － | － | － |
| 抗原 | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | － |
| 緩沖液 | － | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.4 |
| 2U補體 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | － | － | － |
| 1U補體 | － | － | － | － | － | － | － | － | 0.2 | － | － |
| 0.5U補體 | － | － | － | － | － | － | － | － | － | 0.2 | － |
| 混勻，置37℃1h或4℃16～18h | |||||||||||
| 致敏紅
細胞 |
0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 混勻，置37℃30min后觀察結果 |
三、應用和評價
補體結合試驗是一種傳統的免疫學技術，能夠沿用至今說明它本身有一定的優點：①靈敏度高。補體活化過程有放大作用，比沉淀反應和凝集反應的靈敏度高得多，能測定0.05μg/ml的抗體，可與間接凝集法的靈敏度相當。②特異性強。各種反應成分事先都經過滴定，選擇了最佳比例，出現交叉反應的機率較小，尤其用小量法或微量法時。③應用面廣，可用于檢測多種類型的抗原或抗體。④易于普及，試驗結果顯而易見；試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。
補體結合試驗可應用在以下幾方面：①傳染病診斷。病原性抗原及相應抗體的檢測。②其他抗原的檢測。例如腫瘤相關抗原、血跡中的蛋白質鑒定、HLA分型等。③自身抗體檢測。
但是補體結合試驗參與反應的成分多，影響因素復雜，操作步驟繁鎖并且要求十分嚴格，稍有疏忽便會得出不正確的結果，所以在多種測定中已被其他更易被接受的方法所取代。但對于免疫學技術的基本訓練仍是一個很好的試驗。