表觀分子量的判定實驗

目的蛋白標準分子量蛋白

1.將目的蛋白和標準分子量蛋白上樣到同一塊 SDS-PAGE 平板凝膠中，按照方案 1 的步驟進行 SDS-PAGE。

在同一塊平板凝膠上進行目的蛋白和標準分子量蛋白的電泳，可以消除由于丙烯酰胺濃度和電泳條件不同而產生的差異。可以通過商業途徑獲得多種標準蛋白試劑盒，標準蛋白及其分子量的詳細資料也可在 Weber 和 Osborn(1969)、Neville(1971) 以及 Hames(1990) 中找到。若要用此方法更精細地測定分子量，最好能采用不同濃度的丙烯酰胺凝膠（Ferguson,1964;Neville,1971)。關于在使用多種市售標準蛋白進行 SDS-PAGE 時，聚丙烯酰胺和交聯劑兩者濃度對蛋白遷移的影響，在 Makowski 和 Ramsby(1997) 中有詳細討論。

2.電泳結束后，進行蛋白染色（方案 2?~7)。

3.（可選或不選）在測量尺 F 值之前干燥凝膠。

4.測量蛋白和示蹤染料（通常是溴酚藍）遷移的距離。

5.計算相對遷移率（Rf 值）：

R_F=蛋白遷移的距離/示蹤染料遷移的距離

6.用遷移率對已知 Mr 的半對數作圖。凝膠中部各點應幾乎在一直線上（見圖 2.7)。

7.通過未知蛋白的R_F 值從曲線圖上讀出未知蛋白的 Mr。

要點：每塊膠應重新繪制標準曲線。