表達譜基因芯片實驗

按照預定位置固定在固相載體上很小面積內的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。
 

基因芯片基本技術流程圖

組織或細胞樣本

TRIzol異丙醇乙醇氯仿dNTPs雜交試劑盒

電動玻璃勻漿機電子天平低溫高速離心機低溫高速臺式離心機超凈工作臺制冰機電熱恒溫水槽電泳槽電泳儀微波爐凝膠成像儀臺式離心機核酸定量分析儀移液槍可調電爐旋渦混合器雜交箱雜交艙Ｓ-200純化柱真空濃縮儀蓋玻片芯片掃描儀

一、總RNA提取
 

1.  將超低溫保存的樣品除去樣品袋，在電子天平上稱重后，轉移至用液氮預冷的碾缽中，用杵子碾磨組織，其間不斷加入液氮，直至碾磨成粉末狀。
 

2.   將碾磨成粉末狀的樣品，轉移至已經加入適量TRIzol試劑的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中，在組織勻漿粉碎機上進行勻漿。勻漿至勻漿液不粘且無顆粒即可。
 

3.  將勻漿液轉移至15 mL離心管中， 于4℃，12 000 g，離心10 min。
 

4.  小心吸取上清液轉入新的15 mL離心管，在15~30℃放置5 min。
 

5.  向勻漿液中加入氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15~30℃放置3 min。
 

6.  于4℃，12 000 g，離心15 min。
 

7.  從離心機中小心地取出離心管，吸取上清至另一15 mL離心管。
 

8.  向上清加入異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15~30℃放置10 min。
 

9.  于4℃，12 000 g，離心10 min。
 

10.  棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇5 mL，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。
 

11.  再加入75%乙醇10 mL，在渦旋器上短暫渦旋；于4℃，8 000 g離心10 min。
 

12.  小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超凈工作臺中干燥沉淀5 min。
 

13.  加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。
 

二、探針標記與雜交
 

1.  預雜交
 

（1） 配制預雜交液：雜交試劑1加入到的Eppenderf管中，振蕩混勻后，加入雜交試劑2混勻。
 

（2） 將配制好的預雜交液放入95℃水浴鍋內變性2 min，將待預雜交的玻片放入95℃水浴鍋內變性30 s，玻片取出后即放入無水乙醇中30 s，晾干。
 

（3）將已變性的預雜交液加到玻片的點樣區域內，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內42℃預雜交5～6 h。
 

2.  標記探針（以下在冰浴中進行）
 

（1）于一已滅菌的1.5 mL Eppendorf管內依次加入以下試劑(反應終體積為50 uL，以下試劑均為RNase－free)：

ddH₂O  23 uL 

逆轉錄引物  5 uL 

總RNA  50~100ug 

振蕩混勻，置于70℃水浴10 min。取出后，迅速置于冰上。
 

（2） 分別加入以下試劑：

逆轉錄酶緩沖液  10uL 

DTT  5uL 

dNTPs  4uL 
 

（3） 而后在暗室中加入以下試劑：

逆轉錄酶  2 uL 

Cy5-dCTP或Cy3-dCTP  3 uL 
 

（4） 用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2 min。將Eppendorf管置于42℃水浴2 h。
 

（5）依次在Eppendorf管中加入標記試劑I 4uL，65℃水浴10 min后加入標記試劑II 4 uL。混勻，合并對照組、實驗組。避光，真空抽干至50 uL左右。
 

（6）使用DNA純化柱（或乙醇沉淀）純化DNA。
 

（7）將柱體在旋渦混合器上劇烈振蕩搖勻，懸浮內溶的樹脂。將柱頂端的小帽旋松四分之一圈，掰斷柱下端的密封頭。
 

（8）將柱置于一個1.5 mL的Eppendorf管中，以3 000 rpm離心 1min將柱置于另一個新的1.5 mL Eppendorf管中，去掉頂端的帽，將樣品慢慢加到樹脂上表面的中間，注意不要攪動柱體。以3 000 rpm離心2 min，經純化的樣品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。
 

（9）加入標記試劑III 8 uL，真空抽干。
 

3、雜交
 

（1）在抽干的探針管中加6.5 uL雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6.5 uL雜交試劑II，混勻備用。
 

（2）將預雜交的玻片取出，用ddH₂O沖去蓋玻片。
 

（3）將探針置于95℃水浴中變性2 min；玻片置于95℃水浴中變性30 s，玻片取出浸無水乙醇30 s，探針取出后迅速置于冰上。
 

（4）將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內雜交過夜(16～18 h)。
 

4、洗片
 

（1） 用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，去除蓋玻片。
 

（2） 準備兩個染色缸，分別裝有0.5%的洗片試劑1+2%的洗片試劑2、5%的洗片試劑3，放入60℃水浴鍋中。
 

（3） 將玻片依次浸入以上兩個染色缸中洗滌10 min。
 

（4） 用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，晾干后掃描。

一、基因芯片技術步驟

基因芯片技術主要包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結果分析。

1.  芯片制備

目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、準確地將探針放置到芯片上的指定位置。

2.  樣品制備

生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質或DNA、RNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。

3.  雜交反應

雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。

4.  信號檢測和結果分析

雜交反應后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經過芯片掃描儀和相關軟件可以分析圖像，將熒光轉換成數據，即可以獲得有關生物信息。

二、基因芯片種類及特點

目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩大類組成。以下分別介紹這兩類芯片的基本原理和特點：

1.  寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)

概念：是指做在固相載體上的寡核苷酸微陣列。其制備方法以直接在基片上進行原位合成為主、有時也可以預先合成，再按照制備cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法，有幾種不同的工藝，其中最著名的是美國Affymetrix公司(http://www.affymetrix.com)的ZL技術——光引導化學合成法(Light-directed chemical synthesis process)。產品名為GeneChip。

Affymetrix公司已公開的光引導化學合成主要過程如下：首先根據雜交目的確定寡核昔酸探針的長度和序列。再由計算機設計出合成寡核苷酸時用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探針合成。光導原位合成技術的優點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列，探針陣列密度可高達到每平方厘米一百萬個。而這種方法的主要缺點：一是需要預先設計、制造一系列掩模，造價較高：二是每步產宰較低．因此合成探針的長度受到了限制。

此外，原值合成的方法還有Incyte Phamaceuticals5公司(http//www.incyte.com)和Rosetta Biosystem Inc公司等使用的基于噴墨打印原理的原價合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by ink-jet printer devices)。噴印裝置與普通的彩色噴墨打印機類似，用四種堿基液體取代墨盒中的彩色墨汁，通過計算機控制噴印機將特定種類的試劑噴灑到預定的區域上。沖洗、去保護、偶聯等過程與傳統的DNA固相原值合成技術相同。噴印法可以合成長度為40~50 nt的寡核昔酸鏈，每步產率可以達到99％，合成30nt的寡核昔酸產率可達70％以上。日本佳能公司利用其獨創的氣泡噴墨技術，僅用24 pl溶液就可以在基片上制作出近百微米的小探針點。每平方厘米可排布近20000個探針，克服了噴墨打印技術制備探針陣列密度較小的缺點。

寡核昔酸芯片的雜交和檢測分析：樣品處理和雜交檢測方法與cDNA芯片是一致的。由于寡核昔酸陣列多需要區分單堿基突變。因此嚴格控制雜交液鹽離子濃度、雜交溫度和沖洗時間是雜交實驗成敗的關鍵。

2.  cDNA芯片（cDNA Chip）

概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上固定的成千上萬個cDNA分子組成cD4A微陣列。制作cDNA芯片最常用的固相載體是顯微鏡載玻片，載玻片在使用前需要進行表面處理，目的是抑制玻璃片表面對核酸分子的非特異性吸附作用。常用的表面處理方法有氨基化法、醛基化法和多聚賴氨酸包被法。

cDNA芯片的制備：制備cDNA芯片多用合成后點樣法(Spotting after synthesis)，簡稱點樣法。合成后點樣法使用的專用設備稱為點樣儀(Arrayer)，目前有多家國外公司(如Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic Microsystems,Genomicssolutions等)生產點樣儀。點樣儀的主要部件是由計算機系統控制的電腦機械手。點樣時電腦機械手利用點樣針頭(Pin)從96或384檄孔板上蘸取cDNA樣品，按照設計好的位置點在載玻片表面。針頭的數目、機械手的移動時間、針頭清洗和干燥時間、樣品總數和載破片數目共同決定了點樣所需時間；針頭的直徑和形狀、樣品溶液的粘滯程度以及固相載體的表面特性決定了芯片上液滴的量和擴散面積。

除點樣法以外，cDNA芯片也可以用電子定位法(Electronic addressing)制備。美國Nanogen公司(http://www.nanogen.com)最早使用這項技術，他們對空白片上的持定位點進行電活化，使相應活化點的表面帶有電荷，成為微電極，能夠吸附cDNA分子。帶有微電極的片子與樣品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附的微電極上，并與片子表面發生化學結合從而固定。用這種工藝制備的芯片的優點是：微電極的電吸附作用可以提高與靶核酸的雜交效率。缺點是制備復雜．成本較高。這種帶有微電極的芯片也稱為主動式芯片。許多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根據需要從公司定制。美國Incyte公司是顯著名的cDNA芯片提供商之一，其產名為GEMTM芯片，每張片子上最多可以含有10000點，對樣品中mRNA的檢出限達到2pg，對兩種來源樣品中的基因差異表達的檢出限為2倍。

3.  cDNA芯片的使用方法--樣品制備和雜交

樣品制備包括分離和標記兩個方面，有些樣品還嬰經過核酸擴增放大這一步驟。樣品制備的一般過程是：提取待檢樣品中的mRNA，反轉錄成cDNA，同時標記上熒光(熒光標記為最常用的方法。優點是無放射性且有多種顏色可供使用；研究者可以根據需要選用其它標記方法，例如同位素標記法、化學發光法或酶標法；如果目的是研究兩種來源的組織細胞基因的差異表達，則分別提取兩種組織細胞的mRNA，反轉錄成cDNA，分別標記兩種不同顏色的熒光(如Cy3和Cy5)，等量混合后與芯片進行雜交反應。

雜交反應可以在專用的雜交儀(Hybridization station)或雜交盒(Hybridization chamber)內進行。雜交儀能夠容納多張芯片，有利于雜交過程的自動化和雜交條件的標準化。單個反應可以在雜交盒里進行，斯坦福大學Patrick O.Brown教授領導的實驗室將制作雜交盒的詳細說明提供在互聯網，同時還提供了cDNA芯片設備、樣品處理與雜交的完整的實驗手冊和有關軟件的下載，網址是：http://cmgm.stanford.edu/pbrowri/index.html。

4.  雜交信號檢測和分析

通常檢測芯片上的雜交信號需要高靈敏度的檢測系統--閱讀儀(Reader)，閱讀儀的成像原理分為激光共焦掃描和CCD成像兩種。前者分辨率和靈敏度較高，但是掃描速度較慢且價格昂貴。后者的持點與之相反。十祈一次標準的cDNA芯片雜交實驗產生的成干上萬個點的雜交信息，需要生物信息學手段的支持。已經有多種讀取和分析雜交信號的應用軟件以及能夠與網絡公共數據庫連接進行數據分析的應用軟件、在NHGRI的問站可以下載用于圖像分析的軟件，還可以找到能夠與Genbank、Unigene等數據庫聯機工作的軟件包。