西北大學團隊“topdown”質譜法|單日分析上千個單細胞

西北大學研究團隊開發出一種基于電荷檢測質譜技術的自頂向下（top-down）的單細胞蛋白質組學方法。該方法在本月發表于BioRxiv預印本上，科學家們用此方法可以每天檢測1000多個單細胞中的完整蛋白質。雖然該技術的開發仍處于早期階段，但是西北大學生命過程化學研究所主任、論文的通訊作者Neil Kelleher表示，他和他的同事們希望在幾年內能夠與大規模自頂向下蛋白質組學分析取得同等水平。

該方法采用了Kelleher及其共同作者去年在Science Advances上發表的蛋白質變體成像質譜（PiMS）方法，他們使用了一種稱為單個離子質譜（I2MS）的基于電荷檢測質譜技術，使研究人員能夠逐個分析離子，減少了產生的信號的復雜性。研究人員利用這項技術進行了自頂向下的質譜成像。傳統上，這樣的成像實驗局限于相對較小的蛋白質變體，但是I2MS所具有的分離質譜成像產生的復雜離子混合物的能力使得Kelleher及其同事能夠顯著擴展他們所能處理的蛋白質變體質量范圍。他們將I2MS與環境納米噴霧解吸電噴霧離子化技術（nano-DESI）結合起來對人類腎臟組織成像，鑒定了169種質量高達70 kDa的蛋白質變體。

在他們最近的預印本中，Kelleher及其同事將這種技術應用于單細胞的高通量分析。研究人員從大鼠海馬體中取出細胞并將其滴在玻片上。然后，如他們所述，他們掃描玻璃片上的“液滴”，同時不斷使用納米DESI源對液滴進行采樣。當液滴接觸到玻片上的一個細胞時，離子源對細胞內容物離子化，產生蛋白質變體離子，這些離子被引入質譜儀并通過I2MS分析。

使用這種方法，研究人員能夠在大鼠腦細胞中識別出169種蛋白質變體。他們還表明，可以根據所含蛋白質變體將分析的一部分細胞分類為神經元、星形膠質細胞或小膠質細胞。此外，由于該方法不使用液相色譜分離，而是直接將樣本引入質譜儀，因此具有非常高的通量。預印本中使用的工作流程能夠每小時分析約80個細胞。在10天的研究中，研究人員總共分析了10,836個單細胞。

預印本中所展示的研究主要是原理驗證，仍需要進行大量的開發工作，但Kelleher表示，這為高通量收集單細胞自頂向下蛋白質組學數據提供了一種途徑。

自頂向下蛋白質組學很有吸引力，因為通過分析完整的蛋白質，而不是像自底向上蛋白質組學中那樣消化成肽段，研究人員可以更好地觀察剪切變異、截斷和翻譯后修飾等在生物過程中起關鍵作用的特征。

通量是蛋白質組學的一個重要問題，特別是單細胞蛋白質組學需要大量的細胞數據以進行穩健分析，每個細胞構成其自己的質譜實驗。從這個角度，能夠每天分析1,000個以上的單細胞是一大福音。“這非常大膽和令人興奮，”東北大學生物工程副教授、單細胞蛋白質組學的先驅尼古拉伊·斯拉沃夫（Nikolai Slavov）對Kelleher實驗室的自頂向下單細胞研究表示贊賞，“單位時間分析的單細胞數量非常高。”他還指出，收集蛋白質變體信息的能力很重要。“顯然，我們都想知道蛋白質變體，當我們進行自底向上分析時，我們對蛋白質變體的認識是間接的，”他說，“完整蛋白質分析使我們可以直接測量真正想知道的內容。”雖然沒有參與預印本工作，但斯拉沃夫指出，該技術目前還不能產生太多的定量信息，這是Kelleher所承認的一個缺陷。

“定量很難，”Kelleher評論道，在這方面的主要困難之一是引入足夠的離子進入質譜儀以進行良好的定量分析。斯拉沃夫指出，當只有少數蛋白質變體離子成功進入質譜儀時，背景噪音會使其難以準確定量。他說：“解決這個問題主要需要提高離子化效率和傳輸效率。”，“我認為這是未來發展的一個非常重要的方向。”

“我們知道我們沒有得到好的（離子）提取。只有一小部分蛋白質變體從細胞中釋放出來。平均每個細胞只得到約10,000個離子，”Kelleher說，“我們團隊的初步重點是展示這種技術的通量”。他列舉了單細胞RNA測序的例子，表示相信離子提取和定量分析能力可得以顯著提升。他說：“單細胞RNA測序的早期是在2012年、2014年，然后到了2016年，你就可以在一個單細胞中獲得2,000到3,000個轉錄本。我們將經歷同樣的成熟曲線。我希望在三到四年的時間內達到我們可以在大規模（自頂向下分析）中實現的深度。”

最近的大規模自頂向下的研究確定了2,000到3,000種蛋白質和20,000到30,000種蛋白質變體，其中約1,000到2,000種蛋白變體可被重復定量。

自底向上的單細胞蛋白質組學流程也在不斷發展。在本月在休斯頓舉行的美國質譜學會年會上，Bruker突出了其新的timsTOF Ultra儀器在單細胞蛋白質組學方面的能力，在新聞材料中指出該儀器可以在單個細胞水平上識別約5,000種蛋白質，并以<20%的變異系數對超過4,800種蛋白質進行定量分析。此外，維也納分子病理學研究所的蛋白質組學主管卡爾·梅赫特勒在本周的Bruker用戶會議上展示了他的實驗室使用Ultra儀器生成的數據。他的實驗室使用該系統觀察單個HeLa和K562細胞時，分別識別了3,803和3,221種蛋白質。

在通量方面，斯拉沃夫及其同事繼續開發他們的plexDIA方法，該方法將非同位素質量標記與數據獨立獲取質譜相結合，以實現在短的液相色譜梯度上運行多重單細胞質譜實驗。迄今為止，研究人員已經發表了一種結合三重標記和五分鐘液相色譜梯度的版本，但斯拉沃夫表示，他相信多重性水平可以增加到20個，而色譜運行時間也可以大大縮短，可能降至一分鐘左右。